[发明专利]一种调控小尾寒羊骨骼肌生长的CSRP3基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种可以调控小尾寒羊骨骼肌生长的CSRP3基因及其在绵羊育种中的应用。

背景技术

羊肉肉质细嫩，脂肪和胆固醇含量低，逐渐受到人们的青睐。随着羊肉价格的逐渐盘升，提高羊只生长速度、改善羊肉品质对提高动物生产者的经济效益、满足广大消费者对优质羊肉的需求具有重大意义。

CRP家族是LIM结构域蛋白中一类蛋白家族，有四个成员分别是CRP1、CRP2、CRP3、TLP(Weiskirchen et al.,1995；Kirchner et al.,2001)，其中CRP3蛋白的编码基因CSRP3(Cysteine and glycine-rich protein 3)特异性表达于心肌和骨骼肌中。CSRP3基因在肌肉生长发育过程中起重要作用，研究表明CSRP3基因(富含半胱氨酸蛋白3基因)又叫肌肉特异性LIM蛋白(muscle LIM protein，MLP)是一个肌肉分化的正调节因子(Arber et al.,1994)。研究还发现该基因在骨骼肌卫星细胞中作用时期为快肌纤维的早期阶段表达调控，并且发现在增殖速度较慢的成肌细胞中高表达，因而认为该基因可能具有影响成肌细胞增殖而促进肌细胞的分化的功能。另外，CRP3蛋白可以通过某种物理方式与肌肉组织的螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子发生作用，这种作用具有高度的特异性，即CRP3蛋白不与非肌肉组织的bHLH蛋白或其他成肌因子发生作用(Kong et al.,1997)，表明该基因具有表达特异性。

但到目前为止，尚未见到有关小尾寒羊CSRP3基因克隆和功能的研究报道，而其对于肌肉生长和发育的调控作用更是未知。

发明内容

基于上述的原因，本发明提供了一种可以调控小尾寒羊骨骼肌生长的CSRP3基因，其cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，全长899bp；该序列中的开放阅读框编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共编码194个氨基酸；该基因具有调控骨骼肌生长的功能，应用该基因可以通过对该基因的表达调控进行操作，为实现培育生长速度快、肌肉品质好的绵羊品种奠定基础，对养羊业生产有较高的现实意义。

本发明所提供的调控骨骼肌生长的CSRP3基因，cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，CSRP3的cDNA序列长899bp，该序列中的开放阅读框编码194个氨基酸。

上述的CSRP3基因是通过如下方法获得的：

(1)小尾寒羊肌肉总RNA的提取和反转录：

采用TRIzol法提取小尾寒羊肌肉组织总RNA，提取的总RNA用核酸蛋白分析仪进行检测，要求总RNA吸光度OD260/280在1.8至2.0之间，并根据现有技术采用TaKaRa公司的RrimeScript^TM RT reagent Kit试剂盒反转录合成cDNA第一链；

(2)CSRP3基因cDNA序列保守区的扩增：

比对已有物种CSRP3基因的cDNA序列，根据保守区设计上下游引物，以步骤(1)中的cDNA第一链为模板进行PCR扩增，克隆测序得到保守区序列；

(3)应用降落巢式PCR法对CSRP3基因cDNA序列的3′端进行扩增：

根据步骤(2)所得保守区序列设计CSRP3基因的3′特异性内侧和外侧引物；

以步骤(1)中提取的总RNA为模板，以OligodT-AP为引物，反转录获得cDNA第一链模板；

以3′特异性外侧引物和3′通用外侧引物采用降落PCR法以步骤(3)中cDNA第一链为模板进行第一轮PCR扩增；

以3′特异性内侧引物和3′通用内侧引物采用同样降落PCR法，以第一轮PCR扩增产物为模板进行第二轮PCR扩增；

对第二轮PCR产物经克隆测序得到CSRP3基因cDNA序列的3′端序列；

(4)应用RACE法对CSRP3基因cDNA序列的5′端进行扩增：

以步骤(1)中提取的总RNA为模板依次进行去磷酸化处理、“去帽子”反应、接头序列连接反应并以TaKaRa公司的5′-Full RACE Kit With TAP试剂盒反转录合成cDNA的第一链；

根据步骤(2)所得保守区序列设计CSRP3基因的5′特异性内侧和外侧引物；

以5′特异性外侧和5′通用外侧引物，以步骤(4)中得到的cDNA第一链为模板进行第一轮PCR扩增；