[发明专利]一种快速蛋白纯化组合层析柱、试剂盒及制备方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白分离纯化技术领域，具体是涉及一种快速蛋白纯化组合层析柱、试剂盒及制备方法。

背景技术

蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之中分离纯化出所需要的目标蛋白质的方法，是生物技术领域的一个重要技术。该技术难度、成本均高,例如一个生物药品成本的75％都花在了下游蛋白质分离纯化当中。蛋白质分离纯化技术主要有沉淀、透析、层析等，其中层析技术中的常用技术有离子交换层析和分子筛(凝胶过滤)。

离子交换层析(Ion Exchange Chromatography,IEC)是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组份离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。本世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。目前，离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。根据离子交换树脂的性能，分为阳离子交换树脂与阴离子交换树脂。若被分离物质为带正电荷的碱性蛋白质，它们在酸性溶液中较稳定，亲和力强，故采用阳离子交换剂，而酸性物质，在碱性溶液中较稳定，则使用阴离子交换剂，如果欲分离的物质是两性离子，一般考虑在它稳定的pH值范围内带有何种电荷，作为交换剂的选择。离子交换树脂的优点主要是处理能力大，分离范围广，分离容量高，能除去各种不同的离子，可以反复再生使用，工作寿命长，运行费用较低(虽然一次投入费用较大)。

凝胶过滤是利用凝胶(如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)的多孔性，根据被分离物质的分子大小、形状不同扩散到凝胶孔隙内的速度不同，因而通过层析柱的快慢不同而分离的一种层析法。凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶过滤的优点主要有分离条件温和，蛋白质不易变性，收率高，重现性好，工作范围广，分离分子量的覆盖面大等。

由于离子交换树脂与凝胶过滤树脂的分离原理上不同，两种层析交替地使用可以用来分离、纯化高纯度蛋白。然而，这样的蛋白分离纯化过程是一个非常繁琐的过程。通常蛋白粗提液先被添加到离子交换树脂层析柱后，经过洗柱、梯度洗脱、收集不同时间流出的组分，使蛋白粗提液被分离成多个组分，每个组分还需经过其他方法(如SDS-PAGE凝胶电泳)进一步分析找出含目标蛋白组分，然后将含目标蛋白组分添加到凝胶过滤树脂层析柱上进一步分离，收集不同时间流出的组分，再经过其他方法(如SDS-PAGE凝胶电泳)分析找出含相对高纯度目标蛋白的组分。这样的蛋白分离纯化过程不仅需要多个层析柱，还需要设计复杂的缓冲液体系，没有专业培训，无法从事该类工作。因此，有必要开发一种简单的快速蛋白分离纯化层析柱。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种联合使用离子交换树脂与凝胶过滤树脂的层析柱，用该层析柱进行蛋白分离与纯化，操作方便、快速，可大大节省时间，提高工作效率。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种快速蛋白纯化组合层析柱，包括柱体、离子交换树脂层、三片滤片、凝胶过滤树脂层、流出口，所述三片滤片分别设置于柱体内部底面、离子交换树脂层床面上和凝胶过滤树脂层床面上，滤片形状大小与柱体截面相同，孔径大于被分离蛋白，小于离子交换树脂和凝胶过滤树脂，流出口设置在柱体底部。

层析柱的柱体为塑料柱、玻璃柱或金属柱，柱体形状为圆柱形、方柱形或椭圆柱形，滤片为塑料滤片或纸滤片。

进一步的，所述离子交换树脂层的填充高度是柱体内径的0.3-3倍，所述凝胶过滤树脂层的填充高度是所述离子交换树脂层填充高度的2倍以上。

进一步的，所述凝胶过滤树脂层的填充高度是所述离子交换树脂填充高度的5-20倍之间。

一种制备上述快速蛋白纯化组合层析柱的方法，包括如下步骤：

(1)选取层析柱空柱体，清洁后在柱体底部放入一片滤片；

(2)取活化的凝胶过滤树脂或离子交换树脂，用水溶胀充分后，取少量装入柱体，靠重力沉降让水流出，反复装入树脂、沉降，如加入凝胶过滤树脂时，床面达到柱体内径的0.6倍以上后，在床面上轻轻压入一片滤片，如加入离子交换树脂时，床面达到柱体内径的0.3-3倍后，在床面上轻轻压入一片滤片；