[发明专利]一种分析蛋白O-糖基化位点的方法

权利要求书

1.一种分析蛋白O-糖基化位点的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)将蛋白质组样品或单个蛋白样品经内切酶酶切后，再经内切糖苷酶和外切糖苷酶组合切除N糖链与部分O-糖链，经减压干燥，制得带有GalNAc糖标签的肽段和非糖肽的组学蛋白样品或单个蛋白样品；

(2)将步骤(1)制得的带有GalNAc糖标签的肽段和非糖肽的组学蛋白样品上样于榴莲凝集素色谱柱进行分离，收集到酶切后带有GalNAc糖标签的肽段溶液，经减压干燥后，制得组学蛋白样品；

(3)将步骤(1)制得的单个蛋白样品或步骤(2)制得的组学蛋白样品使用C₁₈反相色谱柱分离，然后在正离子模式下用高分辨质谱仪进行检测，得到高分辨质谱图；

(4)将得到的质谱数据用Mascot Distiller软件进行处理，再用MASCOT在SwissProt数据库中进行搜索，参数设定如下：

酶最大漏切位点：2；

固定修饰：Carbamidomethylation，半胱氨酸；

可变修饰：+HexNAc，203Da，丝氨酸和苏氨酸；+0.9840Da，天冬酰胺变成天冬氨酸；氧化，甲硫氨酸；乙酰化，N-末端；环化，N-末端；

母离子质量误差为15ppm，二级碎片质量误差为0.8Da；通过搜库结果获得蛋白糖基化位点信息。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中内切酶为：胰蛋白酶或蛋白内切酶Glu-C，内切酶与蛋白样品的质量比为1：(20～30)。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中内切糖苷酶为：肽N-糖苷酶F。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中外切糖苷酶为：β(1-3,4)半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶和唾液酸酶A的混合；进一步优选的，每100μg经内切酶酶切后的样品或单个蛋白样品加入每种内切糖苷酶和外切糖苷酶的量均为1μl，所述β(1-3,4)半乳糖苷酶的浓度为≥2U/ml、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶的浓度为≥40U/ml、唾液酸酶的浓度为≥5U/ml。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中内切糖苷酶和外切糖苷酶的酶切条件均为：37℃条件下酶切24h。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中榴莲凝集素色谱柱按如下方法制备：将1.7mL的偶联榴莲凝集素的琼脂糖凝胶装于1×1900mm的全氟烷氧基树脂管中，偶联榴莲凝集素浓度为3.5～4.5mg/ml，制得榴莲凝集素色谱柱。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中榴莲凝集素色谱柱的分离条件如下：流速100μL/min，用洗涤缓冲液洗脱8个柱体积，再用含0.8M半乳糖的洗脱缓冲液洗脱5个柱体积；将洗脱液收集后，用HyperSep C18柱脱盐，即得；

所述洗涤缓冲液为100mM Tris–HCl,pH 7.4。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中C₁₈反相色谱柱的流动相A为含有甲酸和乙腈的溶液，甲酸质量浓度为0.1％，乙腈质量浓度为2％；流动相B为含有甲酸和乙腈的溶液，甲酸质量浓度为0.1％，乙腈质量浓度为98％。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中C₁₈反相色谱柱的的检测条件如下：

将步骤(1)制得的酶切后单个蛋白样品或步骤(2)制得的组学蛋白样品溶于流动相A中，配制成浓度为0.5～1.5μg/μL的待测溶液；

流速50μL/min，洗脱梯度为：0～5min，98％流动相A，2％流动相B；5～25min，85～98％流动相A，2～15％流动相B，25～55min，60～85％流动相A，15～40％流动相B，55～60min，2～60％流动相A，40～98％流动相B，60～70min，2％流动相A，98％流动相B。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中高分辨质谱采用LTQ-Orbitrap Velos Pro型高分辨质谱，设定参数为：同位素分辨率：60000；扫描质量范围：400～1800；数据采集采用数据依赖模式；碰撞能量设定为35％。