[发明专利]一种罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于功能性肽技术领域，具体涉及一种罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的制备方法。

背景技术

功能性肽是指对生物机体的生命活动有益或具有特定生理作用的肽类化合物，其对保健食品及生化药物的开发具有极其重要的作用。其中，矿物元素结合肽即促矿物元素吸收肽，是一种具有螯合矿物离子能力的功能性肽，其可在pH值呈中性至微碱性的动物小肠下端，能与矿物离子，如锌离子等结合，阻止矿物离子与磷酸根产生沉淀，使小肠内可溶性的矿物离子浓度增加，并借助小肽的转运吸收特点和机制以螯合物整体的形式通过小肠被主动吸收，从而促进这些必需矿物离子的吸收和利用，可预防因矿物质缺乏而引起的各种疾病。此外，由于矿物元素结合肽可与金属离子螯合，能抑制以金属离子为辅酶或辅基的脂质过氧化反应，并减少由金属离子产生的活性氧，因此其可能具有一定的抗氧化活性。

近年来，以食源性蛋白为原料采用酶解法制备抗氧化肽已取得了很大的进展，获得了较多具有高抗氧化活性的肽段。但目前关于制备兼具抗氧化与促矿物元素吸收的双效功能性肽的方法尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的制备方法，该制备方法制备获得的罗非鱼抗氧化锌元素结合肽具有促进锌离子吸收的生物活性，是一种兼具抗氧化与促锌离子吸收的双效功能性肽。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：一种罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的制备方法，包括以下步骤：

（1）控制酶解：以罗非鱼为原料，粉碎，加水，水温调节至50-60℃，加入木瓜蛋白酶和Alcalase中的一种或两种，酶解至水解度为15-22%，灭酶，离心后，取上清液，得酶解液；

（2）超滤分离：将酶解液采用截留分子量为1-10 kDa的超滤膜过滤，取滤过液；

（3）固定化金属离子亲和层析：将滤过液通过已预先固载好锌离子的IMAC分离柱，然后用pH值为7.0-7.5的纯净水冲洗2-3个柱体积，再用pH值为4.0-4.5的纯净水进行洗脱，收集洗脱液；

（4）真空浓缩、冷冻干燥：将洗脱液经真空干燥和冷冻浓缩，得抗氧化锌元素结合肽。

本发明的原理是：本发明先将罗非鱼酶解再经超滤后得具有抗氧化活性的酶解产物，然后采用IMAC分离柱从酶解产物中把具有锌离子结合能力的组分分离出来，即为抗氧化锌元素结合肽。经过鉴定，罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的主成分结构为二肽结构，具体结构为Lys-Leu或Lys-IIe。

其中固定化金属离子亲和层析，即IMAC，是利用蛋白质、肽等表面暴露的一些氨基酸残基和载体之上的金属离子的亲和力的不同来进行分离纯化的技术，具有配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点，适用于某些蛋白质、肽、氨基酸与酶的分离纯化。

在上述罗非鱼抗氧化锌元素结合肽的制备方法中：

步骤（1）中水的用量为罗非鱼原料总重量的2-3倍。

步骤（1）中灭酶时的温度为85-95℃，灭酶时间为10-20min。

步骤（1）中离心时离心机转速为4000-8000r/min，离心时间为15-30min。

其中步骤（1）中水解度的测定方法：水解度(%)=酶解液中游离氨基态氮含量/原料总氮含量×100，式中：酶解液中游离氨基态氮含量采用甲醛电位滴定法测定；原料总氮含量采用半微量凯氏定氮法测定。

步骤（2）中将酶解液先过截留分子量为3-10 kDa的超滤膜，再采用截留分子量为1kDa的超滤膜过滤，取滤过液；或将酶解液直接采用截留分子量为1kDa的超滤膜过滤，除去未酶解的蛋白，获得所需的小分子肽类。

步骤（3）中预先固载好锌离子的IMAC分离柱的制备过程如下：选取层析柱，先用0.05-0.2mol·L^-1的ZnCl₂或ZnSO₄溶液冲洗0.5-2个柱体积，以实现锌离子在柱子上的固载，再用纯净水冲洗5-10个柱体积，去除未结合的锌离子，即制备获得预先固载好锌离子的IMAC分离柱。

本发明所述的层析柱优选为GE公司生产的HiPrep IMAC FF 16/10预装柱。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

（1）本发明方法制备的罗非鱼抗氧化锌元素结合肽具有与天然抗氧化剂谷胱甘肽相似的抗氧化性，安全无毒，在抗氧化保健方面具有优越性；

（2） 本发明方法制备的罗非鱼抗氧化锌元素结合肽具有促进锌离子吸收的生物活性，是一种兼具抗氧化与促锌离子吸收的新型双效功能性肽；