[发明专利]一种逆转肝癌细胞多药耐药的shRNA及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种逆转肝癌细胞多药耐药的shRNA，尤其是涉及一种干预丛生蛋白基因转录来逆转肝癌细胞多药耐药的shRNA，属于分子生物学与生物医药领域。

背景技术

肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，每年有超过60万的新增肝癌患者，位列肿瘤相关死因的第三位。HCC的发生发展是多病因、多基因、多步骤及多因子协同的复杂过程，涉及到癌基因激活，抑癌基因失活及（或）胚胎期某些癌基因重新复活等多信号通路和基因调控。

目前，多药耐药(multiple drug resistance, MDR)产生是肝癌化疗失败主要原因，已发现肝癌细胞耐受的抗肿瘤药物有多柔比星、顺铂、紫杉醇和依托泊苷等，因此寻找特异有效分子靶点逆转肝癌多药耐药，已是肝癌治疗的研究重点。

丛生蛋白（Clusterin，CLU）又名高尔基体硫酸化糖蛋白-2、丛生蛋白或载脂蛋白J。CLU具有多种生物学功能，如脂转运、膜循环、细胞粘附、细胞凋亡和补体级联等。其基因位于染色体8p21～p12，由8个内含子和9个外显子组成。它广泛存在于哺乳动物组织，种属间高度保守。经选择性剪切最终形成两种蛋白：核型丛生蛋白(nCLU)和分泌型丛生蛋白(sCLU)。研究发现，sCLU可阻止细胞凋亡，而nCLU则促进细胞凋亡。

通常在60kDa处可发现分泌前丛生蛋白(psCLU)，由mRNA直接翻译而成；经选择性剪切，psCLU在Arg227和Ser228间裂解为反相平行的α链和β链，构成成熟的异二聚体糖蛋白sCLU，分子量为75–80kDa；nCLU分子量大小为45-55kDa，无靶向内质网引导肽，不裂解为双链，通过核内信号区(nuclear localization signals, NLSs)介导，在特定条件下由胞质进入胞核。

研究发现，由于晚期高侵袭肿瘤组织中促凋亡蛋白nCLU转化为抗凋亡蛋白sCLU，两亚型相互转变对肿瘤进展具重要调节作用。提高nCLU/sCLU比值可增加对肿瘤细胞的化疗敏感性，间接反映nCLU和sCLU相互拮抗凋亡相关的生物特性。肝细胞恶性转变和癌变过程中CLU异常活化，过表达的CLU既可作为肝癌早期诊断的标志，又可作为肝癌靶向治疗的新靶点，具有开发与应用前景。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种干预丛生蛋白基因转录来逆转肝癌细胞多药耐药的shRNA，干预CLU基因转录逆转肝癌细胞多药耐药的shRNA能高效抑制CLU基因的表达，对靶向或抗癌药物治疗具有优秀的增敏作用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种干预丛生蛋白基因转录来逆转肝癌细胞多药耐药的shRNA，其创新点在于：包括以下四条shRNA模板序列中的任一条或一条以上的任意组合：

CLU-shRNA1：5’-GTAAGTACGTCAATAAGGA-3’；

CLU-shRNA2：5’-GGGAATCAGAGACAAAGCT-3’；

CLU-shRNA3：5’-CAGTGGAAGATGCTCAACA-3’；

CLU-shRNA4：5’-GCGAAGACCAGTACTATCT-3’。

进一步，包括以下三条shRNA模板序列中的任一条或一条以上的任意组合：

CLU-shRNA1：5’-GTAAGTACGTCAATAAGGA-3’；

CLU-shRNA2：5’-GGGAATCAGAGACAAAGCT-3’；

CLU-shRNA3：5’-CAGTGGAAGATGCTCAACA-3’。

进一步，包括以下两条shRNA模板序列中的任一条或两条组合物：

CLU-shRNA1：5’-GTAAGTACGTCAATAAGGA-3’；

CLU-shRNA2：5’-GGGAATCAGAGACAAAGCT-3’。

进一步，所述shRNA模板序列为：

CLU-shRNA1：5’-GTAAGTACGTCAATAAGGA-3’。

本发明的另一个目的是提供一种干预丛生蛋白基因转录来逆转肝癌细胞多药耐药的shRNA的应用，具体为用于制备抗肝癌的药物。

本发明的有益效果如下：

（1） 将本发明的四条寡核苷酸链退火形成双链的shRNA模板，能够高效抑制人HepG2/ADM细胞株CLU基因转录，及CLU蛋白表达。