[发明专利]一种高效液相色谱-二极管阵列法同时测定水产品中多种ATP关联产物的方法

说明书

技术领域

本发明属于分析化学领域，涉及检测水产品中多种ATP关联产物的方法，特别涉及用高效液相色谱—二极管阵列法同时测定水产品中多种ATP关联产物含量的方法。

背景技术

ATP关联产物是由嘌呤碱基、嘧啶碱基、尼克酰胺等与糖磷酸酯组成的一类化合物，如三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、二磷酸腺苷(Adenosine Diphosphate，ADP)、腺苷酸(Adenosine Monophosphate，AMP)、肌苷酸(Inosinic acid，IMP)、次黄嘌呤核苷(Inosine，HxR)、次黄嘌呤(Hypoxanthine，Hx)、鸟苷酸(Guanylic acid，GMP)，腺苷(Adenosine，AdR)，腺嘌呤(Adenine，Ad)、黄嘌呤(Xanthine，Xt)等。它们是水产动物肌肉核苷酸的主要成分，与水产原料的风味和新鲜度紧密相关。在风味方面，如AMP有着压抑苦味的特性，能使食物产生良好的甜味和咸味，Hx会产生苦味，IMP是水产动物肌肉主要的呈味核苷酸，IMP增加食品鲜味的能力比谷氨酸钠强40倍。在鲜度方面，一般认为鱼死后鱼肉内ATP依次降解为ADP、AMP、IMP、HxR和HX，其中HxR、Hx量之和对ATP关联物总量的比值即为K值。K值作为鱼类鲜度指标已被公认。对于贝类，SaitoHuArai和wamoto嘲等对几种双壳动物的肌肉进行分析，发现在蛤蜊和扇贝中，ATP及其关联物的降解过程为ATP→ADP→AMP→AdR→HxR→Hx→Xt，而在舟贝、毛蚶和鲍鱼中按途径ATP→ADP→AMP→AdR→Ad进行。因此，快速准确检测出鱼体中的ATP及其关联产物对水产原料的风味和新鲜度有很重要的意义。

目前国内外测定ATP关联物含量的方法主要有离子交换液相色谱法、毛细管电泳法和反相液相色谱法等。离子交换色谱法对核苷酸等兼性离子化合物能很好的分离，但其需要对分离柱进行平衡(再生)，且分析时间较长；高效毛细管电泳法对各种呈味核苷酸的分辨率较高，但仪器昂贵；反相高效液相色谱法具有快速、操作简便的优点，是目前生物、食品等研究领域主要使用的方法，但以往的反相高效液相色谱法分离的核苷酸或种类有限，或采用离子对试剂法分离，造成待测核苷酸相互有干扰或分析时间过长。如：刘亚等用高效液相色谱法测定了马氏珠母贝肉中的ATP关联产物(食品与发酵工业，2008，36(6)：137-141)，该法只测定了6种ATP关联产物，可能存在其他核苷酸的干扰。杨文鸽、陈舜胜等采用离子对高效液相色谱法测定了水产品中ATP降解产物(农业工程学报,2007,(06).217-222)、(水产学报,2011,35(11).1745-1752)，离子对高效液相色谱法稳定时间过长，分离度不好，分析效率低，且对柱子污染大，暂时还没有一种设备要求低、不采用离子对试剂、分析效率高且定性稳定、能够同时测定水产品中该9种ATP关联产物的高效液相色谱法。

发明内容

本发明目的是提供一种操作简单、分离速度快、不使用离子对试剂且定量定性准确，能够同时测定水产品中多种ATP关联产物的高效液相色谱-二极管阵列法，解决以上现有技术中存在的分离效果不好、种类有限、分析时间过长、柱子污染严重及定性不准确等不足。

所测定的ATP关联产物为三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、二磷酸腺苷(Adenosine Diphosphate，ADP)、腺苷酸(Adenosine Monophosphate，AMP)、肌苷酸(Inosinic acid，IMP)、次黄嘌呤核苷(Inosine，HxR)、次黄嘌呤(Hypoxanthine，Hx)、鸟苷酸(Guanylic acid，GMP)，腺苷(Adenosine，AdR)，腺嘌呤(Adenine，Ad)和黄嘌呤(Xanthine，Xt)中的至少一种。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

使用带有DAD(二极管阵列)检测器的高效液相色谱仪进行检测，将待测样品提取液加入到高效液相色谱仪中，梯度洗脱。

用二极管阵列检测器扫描确定检测各ATP关联产物的最佳检测波长(紫外最大吸收波长和200～400nm下的紫外吸收光谱，根据特征光谱确定各色谱峰是哪一种ATP关联产物。

10种ATP关联产物的紫外最大吸收波长分别为：三磷酸腺苷259.1nm、二磷酸腺苷253.2nm、腺苷酸248.4nm、肌苷酸259.1nm、次黄嘌呤核苷248.4nm、次黄嘌呤259.1nm、鸟苷酸260.3nm、腺苷248.4nm、腺嘌呤259.1nm、黄嘌呤267.4nm。