[发明专利]蛋白质‑高分子结合体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及蛋白质-高分子结合体及其制备方法。

背景技术

蛋白质(例如抗体)已经广泛应用于生物医药显影、靶向治疗以及临床诊断等多个领域。单独使用蛋白质存在半衰期短、溶解性差等问题。将蛋白质与高分子相连制备蛋白质-高分子结合体，可以有效的提高蛋白质的溶解性、稳定性、药代动力学和治疗功效并降低其免疫原性。传统的蛋白质-高分子结合体的合成方法是将预先制备好的高分子与蛋白质相连，往往存在着偶联位点不确定、效率低、产率差、产物难以分离、质量控制差、活性难以保持等诸多难题。因此，迫切需要设计一种通用的方法，以有效的解决上述难题。

为解决上述问题，提出了一些蛋白修饰修饰方法，例如设计缓释给药系统，如制备脂质体和微球、白蛋白融合，基因突变引入对蛋白酶不敏感氨基酸等，但均存在一些问题。脂质体包封率低，突释和释放不完全产生不良反应，并且在制备过程强烈的物理、化学变化导致的蛋白变性失活。此外，白蛋白融合需在真核体系中表达，产率低，成本高。引入特殊氨基酸可能降低蛋白活性，并且无法解决肾脏的排空问题。

干扰素-α2(IFN-α2)是病毒复制和肿瘤细胞生长的强效抑制剂，已被成功用于治疗病毒性肝炎和癌症等疾病。但是，IFN经系统注射给药后循环半衰期非常短，需要频繁给药且在高浓度下才能达到预期的疗效，从而导致一些毒副作用，同时给患者带来沉重的经济负担。用聚乙二醇(PEG)修饰IFN，是改善其药代动力学和提高其疗效的有效措施，被称为长效干扰素。然而，目前的PEG化干扰素存在如反应产率低、结合位点和偶联化学计量难以控制、生物活性严重降低等弊端。

发明内容

为了提高蛋白质-高分子结合体中蛋白质与高分子偶联的稳定性和效率，促进产物的分离、质量的控制和蛋白质活性的保持，本发明提供了一种制备蛋白质-高分子结合体的方法，其中，所述高分子通过连接到所述蛋白质的引发剂而结合到所述蛋白质上，其中，所述蛋白质选自医药、农业、科研以及其它工业领域相关的蛋白、小肽和抗体，优选粒细胞集落刺激因子、胰高血糖素样肽-1及其类似物或水蛭素。

所述高分子连接到所述蛋白质的N-或C-端及其它任何远离所述蛋白质的活性的位点和/或不干扰所述蛋白质的活性的位点。例如，利用粒细胞集落刺激因子唯一不配对半胱氨酸Cys17与带有马来酰亚胺基团引发剂特异性反应，通过活性聚合原位生长高分子。通过基因工程手段在胰高血糖素样肽-1类似物C端引入半胱氨酸或非自然氨基酸与引发剂特异性结合并生长高分子。

根据一个实施方式，所述方法可包括：a1)制备蛋白质-引发剂的结合体；b1)所述蛋白质-引发剂结合体在缓冲液中与高分子单体混合，在催化剂作用下引发所述高分子的单体聚合而制备出所述蛋白质-高分子结合体。

根据另一个实施方式，所述方法可包括：a2)所述引发剂在催化剂作用下引发所述高分子单体的聚合，生成所述高分子；b2)所述高分子通过所述引发剂与所述蛋白偶联，制备所述蛋白质-高分子结合体。

根据一个实施方式，通过选自基因突变、引入非天然氨基酸、氧化还原、酶催化、正交化学的化学或生物修饰方法在所述蛋白质上引入的引发剂的结合位点。

根据一个实施方式，所述高分子由单体通过聚合反应生成，所述聚合反应可选自原子转移自由基聚合反应(ATRP)、可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)、开环异位聚合(ROMP)、开环加成聚合以及它们的组合。

根据一个实施方式，引发所述原子转移自由基聚合反应的催化剂选自铜离子、二联吡啶及其衍生物配体、π受体衍生物配体、氮原子螯合配体以及脂肪多胺类配体。引发所述可逆加成-断裂链转移聚合反应的催化剂选自4，4′-偶氮(4-氰基戊酸)、2，2′-偶氮[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐、2，2′-偶氮[2-(2-咪唑啉-2-y1)丙烷]-无水焦硫酸盐、2，2′-偶氮(2-乙基丙脒)二盐酸盐的水溶性的自由基引发剂。引发所述开环异位聚合的催化剂选自水溶性的Grubbs催化剂。