[发明专利]一种细胞治疗用临床治疗级表皮干细胞应用人类细胞外基质筛选及规模化培养制备方法

权利要求书

1.一种用于筛选和培养表皮干细胞的培养基组合， 

培养液A：灭活胎牛血清40～60ml、转铁蛋白5～15μg/ml、维生素B40.5～1×10-4/L、维生素C1～3μg/ml、胰岛素2～4μg/ml、青霉素50-100u/ml、霍乱霉素2.5～4.5u/L、EGF5～25ng/ml、氢化可的松0.4μg/ml、DMEM/F12(3∶1)定容到500ml； 

培养液B：灭活胎牛血清80ml、转铁蛋白6～17μg/ml、腺苷10～25mg/ml、维生素B40.5～1×10-4/L、胰岛素2～3μg/ml、EGF5～25ng/ml、牛脑垂体提取物(BPE)1～3mg/L、干细胞生长因子(SCF)5～40ng/ml、氢化可的松0.3μg/ml、霍乱霉素2.5～4.5u/L、维生素C1～3μg/ml、DMEM/F12(1∶1)定容到500ml，pH 7.2～7.4； 

培养液C：灭活胎牛血清60ml、转铁蛋白6～17μg/ml、腺苷10～25mg/ml、维生素B40.5～1×10-4/L、维生素C1～3μg/ml、胰岛素4～6μg/ml、EGF5～25ng/ml、bFGF10～18ng/ml、牛脑垂体提取物(BPE)1.5～3mg/L、干细胞生长因子(SCF)10～40ng/ml、氢化可的松0.3μg/ml、DMEM/F12(1∶1)定容到500ml，pH7.2～7.4。 

2.一种制备高拟体内细胞外基质的方法，包括以下步骤：a)取材及皮肤消毒处理；b)脱细胞处理；优选地，还进一步包括将消毒或经脱细胞处理的皮肤进一步进行低温、脱水、辐照灭菌处理；更优选地步骤b)的脱细胞方法选自冷酶交联剂法、酶-非离子表面活性剂-络合剂联合法、络合剂加盐-阴离子表面活性剂法或胰酶联合EDTA交联液法。 

3.权利要求2所述方法，其中冷酶交联剂法是：加入0.1～0.25％蛋白酶冰浴冷消12～48h。用含0.25％戊二醛磷酸缓冲溶液，PH在7.20～7.40之间，交联4～6h，超纯水或注射用水冲洗8～10次。 

4.权利要求2所述方法，其中酶-非离子表面活性剂-络合剂联合法是：0.1～0.25％中性蛋白酶与0.01～0.02％EDTA，TritonX-100(0.3～0.6％)溶液，室温下作用24～48h。 

5.权利要求2所述方法，其中络合剂加盐-阴离子表面活性剂法是：0.01～0.02％EDTA含0.6～0.8mol/L氯化钠溶液，37℃下作用12～24h，后用(0.2～0.5％SDS溶液，室温下作用30～60min)。 

6.权利要求2所述方法，其中胰酶联合EDTA交联液是：0.25～0.40％胰蛋白酶和0.02～0.04％EDTA(1∶2)，37℃快速消化10～60min。交联液中交联4～6h。交联后用超纯水或注射用水冲洗8～10次。 

7.由权利要求2-6所述任一方法制备的高拟体内细胞外基质。 

8.权利要求2-6所述任一方法制备的高拟体内细胞外基质或者权利要求7所述的高拟体内细胞外基质在筛选表皮干细胞中的用途。 

9.一种利用权利要求1所述的培养基组合和权利要求7所述的高拟体内细胞外基质筛选和培养表皮干细胞的方法，包括： 

a)制备表皮细胞悬液：取材，消化，剥离表皮收集皮片，消化，用权利要求1所述的培养液A终止消化，收集细胞混悬液。离心后加入培养液A养液； 

b)表皮干细胞的筛选及培养：将权利要求7所述的高拟体内细胞外基质加入权利要求1所述的培养液B，加入步骤a)制备的细胞悬液，培养，清洗，目标表皮干细胞贴壁粘附于高拟体内细胞外基质，加入权利要求1所述的培养液C进行扩增培养； 

c)消化富集传代培养：消化，离心后加入权利要求1所述的培养液C进行扩增培养。 

优选地，免疫逃逸方法处理取材前皮肤或获得细胞，免疫逃逸方法可以为射线法、低温冻融法。