[发明专利]一种用于单细胞全基因组扩增的试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于单细胞全基因组扩增的试剂盒及其应用。

背景技术

随着流式细胞仪和激光显微切割技术的应用发展，分离单个目标细胞成为一件相 对容易的事情。单细胞具有该物种的全部基因组信息，与获自多细胞的基因组样本相 比，获自单细胞的基因组样本没有细胞异质性等缺陷，因此单细胞具有重要的遗传分 析应用价值。随着第二代高通量测序技术的成熟与推广应用，基于基因测序的遗传学 分析也随之发展起来，然而大多数遗传分析最基本的要求是具有足够数量的高质量基 因组DNA，为了使单细胞能够满足遗传分析的需求，如何从单细胞样本中获得足够多 的高质量基因组DNA就成了一个关键技术。

全基因组扩增技术(WholeGenomeAmplification，WGA)是一种从有限DNA或 者单个细胞中产生足量DNA的体外扩增方法。当前，主要有两种不同的策略来实现 WGA，分别是基于PCR的扩增策略和基于Phi29DNA聚合酶的恒温扩增策略。其中最 具代表性的方法包括简并寡核苷酸引物PCR(DegenerateOligonucleotide-Primed PCR,DOP-PCR)和多重置换扩增(MultipleDisplacementAmplification,MDA)。 越来越多的研究发现，以DOP-PCR为代表的基于PCR的WGA，会出现覆盖率低、杂合 子丢失，不能在单个核苷酸的分辨率上评价单个细胞的遗传学特征等缺陷，这些都极 大限制了该技术的应用范围。相较于DOP-PCR，MDA是目前公认为最好的WGA。MDA利 用随机引物与模板DNA在多个位点退火结合，随后Phi29DNA聚合酶在多个退火结合 位点处同时起始复制，Phi29DNA聚合酶沿着模板合成新的DNA，同时取代模板的互 补链，被置换的互补链又成为新的模板，被随机引物结合后进行扩增。基于Phi29DNA 聚合酶的MDA具有以下优点：(1)不需要经过高温变性，用相对较温和的碱性裂解法 使DNA释放，能减少模板的降解；(2)Phi29DNA聚合酶对模板有很强的结合能力， 同时具有3'→5'外切酶活性，可以保证DNA复制的高保真性；(3)Phi29DNA聚合酶 具有很强的连续合成能力，扩增产量高，可以满足所有下游的核酸分析要求。

目前，市场上的MDA试剂盒以QIAGEN公司生产的REPLI-g系列产品为主，其高 效稳定的扩增效果拥有很高的评价。但是，伴随而来的高扩增成本，也成为制约其产 业化道路的重要因素。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于单细胞全基因组扩增的试剂盒及其应用。

本发明首先保护一种用于单细胞基因组扩增的试剂盒，包括扩增体系乙；

所述扩增体系乙由10×Phi29buffer、水和扩增体系甲组成；

单份扩增体系甲由(1.8-2.2)×10^-8moldNTP、引物总浓度为(1.8-2.2)×10^-11mol N8primers、(4.5-5.5)×10^-3mgBSA、0.0045-0.0055μlPluronicF68和9-11UPhi29 DNA聚合酶组成；所述N8primers为随机引物，由8个脱氧核糖核苷酸组成，A、G、 C和T随机排列。

所述单份扩增体系甲具体可由2×10^-8moldNTP、2×10^-11mol所述N8primers、5 ×10^-3mgBSA、0.005μlPluronicF68和10UPhi29DNA聚合酶组成。

本发明还保护另一种用于单细胞基因组扩增的试剂盒，包括扩增体系乙；

单份扩增体系乙为40.3μl，由30μlH₂O、5μl10×Phi29buffer、2μldNTP溶 液、2μlN8primers溶液、0.25μl20mg/ml的BSA水溶液、0.05μl10％PluronicF68 溶液和1μlPhi29DNA聚合酶溶液组成；

所述dNTP溶液中，dATP/dTTP/dCTP/dGTP的浓度均为10mM；所述N8primers溶 液中，引物总浓度为10μM；所述10％PluronicF68溶液中，10％代表体积比；所述 Phi29DNA聚合酶溶液中Phi29DNA聚合酶的浓度为10U/μl；