[发明专利]构建可变区测序文库的方法及确定可变区核酸序列的方法

权利要求书

1.一种构建可变区测序文库的方法，其特征在于，包括：

以含有编码所述可变区的核酸样本作为模板，扩增编码所述可变区的核酸，以便获得第 一扩增产物；

在所述第一扩增产物的两个末端至少之一添加测序接头，以便获得所述可变区测序文 库，

其中，

所述扩增采用下列引物：

第一引物，所述第一引物包括至少一个特异性识别V区的框架区编码序列的核酸分子； 以及

第二引物，所述第二引物包括至少一个特异性识别J区或C区编码序列的核酸分子。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一引物和所述第二引物进一步含 有适于扩增所述测序接头的核酸序列，

任选地，所述含有编码所述可变区的核酸样本为从动物外周血或骨髓中提取的全基因组 DNA或总RNA的至少一部分，

任选地，所述动物为血液癌症患者或者曾经患有血液癌症的人。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述核酸样本包括全基因组DNA或总 RNA的至少一部分，对于RNA样品，在进行所述扩增之前，预先利用第三引物对所述总 RNA的至少一部分进行反转录处理，

其中，所述第三引物包括至少一个特异性识别恒定区编码序列的核酸分子，

任选地，所述恒定区为BCR或TCR的恒定区。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述可变区为BCR或TCR的可变区。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述第一扩增产物的两个末端至少之 一添加测序接头是通过下列进行的：

将所述第一扩增产物进行末端修复，以便获得经过末端修复的第一扩增产物；以及

将所述经过末端修复的第一扩增产物与含有测序接头序列的寡核苷酸连接，以便获得具 有接头的第一扩增产物，

任选地，所述含有测序接头序列的寡核苷酸进一步包括标签序列，

任选地，对所述具有接头的第一扩增产物进行二次扩增，以便获得第二扩增产物，其中， 所述第二扩增产物构成所述测序文库。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述第一扩增产物的两个末端至少之 一添加测序接头是通过下列进行的：

采用含有测序接头序列的引物对所述第一扩增产物进行二次扩增，以便获得具有接头的 第二扩增产物，其中，所述第二扩增产物构成所述测序文库，

任选地，所述含有测序接头序列的引物进一步含有标签序列，

任选地，编码所述可变区的核酸为T细胞受体β链，所述第一引物包括SEQIDNO： 1-32所示核酸序列，所述第二引物包括SEQIDNO：33-45所示核酸序列，

任选地，编码所述可变区的核酸为人类免疫球蛋白重链，所述第一引物包括SEQIDNO： 46-57所示核酸序列，所述第二引物为SEQIDNO：58所示核酸序列。

7.一种确定可变区核酸序列的方法，其特征在于，包括：

根据权利要求1～6任一项所述的方法，构建可变区测序文库；以及

对所述可变区测序文库进行测序，以便确定可变区核酸序列，

任选地，所述测序为高通量测序，所述高通量测序是利用选自Hiseq、Miseq、454、SOLiD、 IonTorrent以及CG测序平台的至少之一进行的。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述可变区为TCR或BCR的可变区。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，进一步包括：

基于所述可变区核酸序列，确定TCR或BCR的V-J谱多样性，

任选地，所述V-J谱多样性是通过分别确定各种V基因和J基因的频率以及各种V-J组 合的频率来确定的。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，

针对患者，确定可变区核酸序列，并且确定各克隆的丰度，选择丰度超过预定阈值的克 隆作为标志物，所述丰度是通过下列公式确定的：

每个克隆的相对丰度＝该克隆的reads数/所有克隆的总reads数，

任选地，所述预定阈值是基于健康群体确定的，

优选地，所述预定阈值是基于健康人群外周血或骨髓中存在的最高克隆丰度确定的，

任选地，进一步包括：

确定患者不同阶段的可变区核酸序列，并且

对不同阶段的可变区核酸序列中的标志物进行分析。