[发明专利]一种长效蛋白质药物表达复性修饰的双标签载体及方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种长效蛋白质药物表达复性修饰的双标签载体及方法。

背景技术

自基因重组技术发明以来(Hannig,G.,and Makrides,S.C.(1998).Strategies for optimizing heterologous protein expression in Escherichia coli.Trends Biotechnol.16,54–60.)，重组蛋白质多肽药物逐渐取代了传统来源的蛋白质药物，比如人重组胰岛素基本已经完全取代来自动物胰脏的胰岛素来治疗糖尿病(EP2374888A1,EP0437320A1)。目前重组蛋白质药物的市场已经在全球范围内达1400亿美元，而且随着抗体药以及其他蛋白类新药的发现，这个市场持续以高增长率维持相当长的一段时间。

重组蛋白质药物的生产也从早期在大肠杆菌宿主中表达，演化到现在可以在从原核到真核细胞，乃至人体细胞中表达，满足一系列不同蛋白质的表达需求。但大肠杆菌仍然是科研和工业市场上的首选，其显著特点是表达量高(50％总蛋白以上)，生长快(20-30分钟细胞分裂一次)，分子生物学操作简单，体系成熟。对于表达来自原核或者溶解度高的蛋白质多肽，大肠杆菌具有首选的技术优势。但是对于很多来自真核或者人源的蛋白质，在大肠杆菌中的高产量可溶性表达是个难题，很多蛋白质的表达都是以包涵体的形式存在。

包涵体是蛋白质在大肠杆菌中高速表达或者没有正确的翻译后修饰导致的蛋白质聚集体。虽然其中的蛋白质没有活性，但可以屏蔽的蛋白酶的水解而保存完整的序列。如果有合适的复性手段就可以完美的解决这个矛盾。

但包涵体蛋白质复性目前仍然被认为是世界性难题(Vallejo,L.F.,and Rinas,U.(2004).Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins.Microbial Cell Factories 3,11.)。每一个蛋白质的复性方法都不尽相同，很难有通用的方法，而且一般主流复性手段如稀释复性的产率很低，后续纯化工艺难度大。根据目前蛋白质复性数据库的数据(http://refold.med.monash.edu.au/)，稀释复性的产率一般位于1％到20％之间，不同蛋白质复性的效率不一样且难以预测，这给重组人源蛋白质药物的大规模、低成本生产带来很大的困难。因此在过去几十年的蛋白质复性技术发展过程中，科学家们发明出多种复性方法，包括稀释法、透析法、柱上复性以及各种复性添加剂的开发(Coutard,B.,Danchin,E.G.J.,Oubelaid,R.,Canard,B.,and Bignon,C.(2012).Single pH buffer refolding screen for protein from inclusion bodies.Protein Expression and Purification 82,352–359.

Vallejo,L.F.,and Rinas,U.(2004).Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins.Microbial Cell Factories 3,11.

Vincentelli,R.,Canaan,S.,Campanacci,V.,Valencia,C.,Maurin,D.,Frassinetti,F.,Scappucini-Calvo,L.,Bourne,Y.,Cambillau,C.,and Bignon,C.(2004).High-throughput automated refolding screening of inclusion bodies.Protein Science 13,2782–2792.)。单就复性成本来说，柱上复性成本最高，而且需要扎实的蛋白质纯化工艺知识。但从蛋白质折叠数据库的数据来看，柱上复性一般都可以给出更好的复性效率。