[发明专利]香蕉水通道蛋白基因启动子及其应用

权利要求书

1.一种香蕉水通道蛋白基因启动子，其特征在于；其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.用于获得权利要求1所述香蕉水通道蛋白基因启动子的引物对，其特征在于；所述引物对为：

正向兼并引物：5'-NTCGASTWTSGWGTT-3'；

三轮反向引物：

第一轮反向引物pr1：

5'-AAACAGTGTAGACGAGGATGAAGGTG-3'；

第二轮反向引物pr2：

5'-GGTACAGTAGACCAAGGCAAAGAT-3'；

第三轮反向引物pr3：

5'-CCTGTAGAAGGACCAAGAGGTGAGC-3'。

3.一种权利要求1或2所述香蕉水通道蛋白基因启动子的获得方法，其特征在于：以具有香蕉水通道蛋白基因的香蕉基因组DNA为模板，采用以下引物对：

正向兼并引物：5'-NTCGASTWTSGWGTT-3'；

三轮反向引物：

第一轮反向引物pr1：

5'-AAACAGTGTAGACGAGGATGAAGGTG-3'；

第二轮反向引物pr2：

5'-GGTACAGTAGACCAAGGCAAAGAT-3'；

第三轮反向引物pr3：

5'-CCTGTAGAAGGACCAAGAGGTGAGC-3'。

进行三轮PCR扩增，其所获得的香蕉水通道蛋白基因启动子为SEQ IDNO.1。

4.一种重组表达载体，其特征在于：它含有权利要求1所述香蕉水通道蛋白基因启动子的植物表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，所述植物表达载体为pCAMBIA1304。

6.一种权利要求4或5所述重组表达载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)以香蕉水通道蛋白基因启动子SEQ IDNO.1为模板设计引物对，且引物对分别上加ECORI、SPeI酶切位点和保护碱基，如下：

正向引物P1：

5'-CGGAATTCATCGAGTATGGTGTTCCTATGCT-3'，

反向引物P2：

5'-GGACTAGTCTATCACTATCTATCTCCCCTGT-3'；

2)以香蕉水通道蛋白基因启动子SEQ IDNO.1为模板进行PCR，PCR扩增条件如下：

94℃预变性3min；94℃变性40s、55℃退火40s、72℃延伸40s，共35个循环；72℃延伸8min；获得PCR产物；

3)用ECORI、SPeI将PCR产物进行酶切，纯化回收；同时，用ECORI、SPeI将pCAMBIA1304载体进行双酶切，去除CaMV35S启动子，酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳检测并回收大片段；

4)在10μl体系中，将回收的pCAMBIA1304载体大片段和回收的PCR产物用T4连接酶4℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将筛选得到的阳性克隆用ECORI、SPeI进行酶切验证，获得得到表达Gus基因的植物重组表达载体pCAMBIA1304：MaPIP1；1-Promoter。

7.含有权利要求4和5所述重组表达载体的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为农杆菌EHA105。

8.下述各项之一在培养干旱性和盐害性植物中的应用，其特征在于：

(1)权利要求1所述的启动子；

(2)权利要求4或5所述的重组表达载体；

(3)权利要求7所述的农杆菌EHA105。

9.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的植物为拟南芥。

10.一种培育具有干旱性和盐害性的转基因植物的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)启动子克隆；

2)植物表达载体构建；

3)受体的遗传转化；

4)阳性转基因植株的鉴定；

5)抗旱性和耐盐性表型及生理分析。