[发明专利]一种检测人类Y染色体微缺失的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及染色体缺失检测领域，具体涉及一种检测人类Y染色体微缺失的试剂盒。

背景技术

人类Y染色体长臂上存在与精子生成密切相关的无精子因子(Azoospermia factor，AZF)，无精子因子发生微小的DNA片段缺失称之为Y染色体微缺失。发生Y染色体微缺失，会引起精子生成障碍，导致少、弱、畸形精子症甚至无精子症。据WHO统计，男性原发性无精子症与少精子症患者中约10％-15％存在Y染色体微缺失。在精子生成障碍引起的男性不育患者中，Y染色体微缺失的发生率是居于第二位的遗传因素。

目前，AZF被划分为3个区，即AZFa、AZFb和AZFc，这些区域的任何一个或多个缺失都将导致精子发生障碍，造成少、弱、畸形精子症甚至无精子症，最终导致不育。在AZF的3个区中，每个区域均有明确的序列标签位点(Sequence tagged site，STS)可供识别；每个区域的缺失机理和缺失的断裂点均已明确。由欧洲男科协会(European Academy of Andrology，EAA)和欧洲分子遗传质控网(European Molecular Genetics Quality Network，EMQN)联合发布的1999版、2004版和2013版《Y染色体微缺失分子诊断实践指南》均推荐使用多重PCR-琼脂糖凝胶检测STS的方法来检测Y染色体的微缺失。同时，指南推荐每个区域检测2个STS，分别为AZFa检测sY84和sY86，AZFb检测sY127和sY134，AZFc检测sY254和sY255，若每个区域的2个STS同时发生缺失时，则代表该区域发生缺失；并指出通过以上6个STS可以检测出几乎所有临床相关的微缺失或95％文献报道的AZF微缺失，足以满足常规诊断。

现有的产品均能检测指南推荐的6个STS，即：sY84、sY86、sY127、sY134、sY254、sY255，但现有包含ZFX/Y和SRY双内控的产品均是不同管内扩增不同的内控。在进行多管多重PCR扩增时，要对每一管反应体系的正常扩增进行监控，而不同内控不能有效地监控多管反应体系检测的稳定性和可靠性。

另外，现有产品采用的技术平台也具有局限性。

1)多重PCR-琼脂糖凝胶电泳。首先，琼脂糖凝胶电泳的检测方法，检测灵敏度低，产物量(上样量)较少时条带不易判别，难以区分弱阳性与阴性，容易造成假阳性或假阴性；其次，该方法的分辨率低，扩增片段之间必须达到30bp以上，才能较好区分；再者，琼脂糖凝胶电泳从制胶、上样到信号读取，均需人工操作，工作量大。

2)其他平台，如北京阅微(CN102912028A)采用测序仪进行检测，北京海斯特(CN103571957A)采用DHPLC进行检测。测序仪和HPLC价格昂贵，仪器操作和结果判读专业性要求高，不利于推广。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种在一次试验中所有PCR反应体系采用同一个内控ZFX/Y进行监测，能方便、快速、可靠地检测人类Y染色体微缺失的试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：提供一种检测人类Y染色体微缺失的试剂盒，包括PCR反应液Ⅰ、PCR反应液Ⅱ、PCR反应液Ⅲ；

所述PCR反应液Ⅰ包括：

特异性扩增ZFX/Y位点的引物，序列如：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；ZFX/Y位点荧光探针，序列如SEQ ID NO：3；

特异性扩增Y染色体sY254位点的引物，序列如：SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；sY254位点荧光探针，序列如SEQ ID NO：6；

特异性扩增Y染色体sY134位点的引物，序列如：SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；sY134位点荧光探针，序列如SEQ ID NO：9；

特异性扩增Y染色体SRY位点的引物，序列如：SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示；SRY位点荧光探针，序列如SEQ ID NO：12；

所述PCR反应液Ⅱ包括：

特异性扩增ZFX/Y位点的引物，序列如：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；ZFX/Y位点荧光探针，序列如SEQ ID NO：3；

特异性扩增sY84位点的引物，序列如：SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示sY84位点荧光探针，序列如SEQ ID NO：15；