[发明专利]一种转基因羊卵母细胞的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种卵母细胞的筛选方法。

背景技术

自1982年转基因鼠问世以来，转基因动物在疾病模型、医药、品种培育、环境保护及资源保藏等领域取得了突破性的进展。随着转基因动物应用的不断扩大和人们对生物安全的担忧和关注，转基因动物生物安全研究应运而生。转基因动物生物安全研究立足于转基因动物及其产品的潜在风险，它与目的基因及其操作方式密切相关。转基因动物的目的基因和表达产物，以及在长期使用与积累过程中，都有可能带来新的风险。为防范转基因生物对环境及人类健康的风险,并促进转基因产业的健康发展,转基因动物研究的每一环节都要经过严密的检测和评价，尽可能地防范一切有害于人类健康、动物健康和环境安全的因素。

DNA甲基化是最基本的表观遗传修饰方式之一，对哺乳动物的发育至关重要。DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶(Dnmts)的作用下，由S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体，在基因组内CpG二核苷酸中胞嘧啶的5位碳原子加上一个甲基基团(5mC)。DNA甲基化分为维持甲基化和从头甲基两种模式，参与很多重要的发育事件，例如，基因表达调控、基因组印迹、X染色体失活及异染色质的形成。DNA甲基化对于哺乳动物生殖细胞的分化和发育至关重要，基因组DNA甲基化处于动态的重编程过程中，主要表现为原始生殖细胞要经历一个普遍的去甲基化过程，而成熟配子的基因组则是高度甲基化的。受精后，合子基因组也发生广泛的主动去甲基化，而植入后胚胎则发生普遍的新甲基化。

通过显微注射方法生产的转基因羊，外源基因的随机插入，以及目的基因过表达，是否影响卵母细胞的甲基化水平尚不清楚。另外，显微操作也是影响卵母细胞甲基化水平的重要因素。由于转基因动物稀缺，尤其是大家畜动物，因此从生殖健康这个角度评估转基因动物安全性困难重重，如取材困难，实验周期长等。我们发明新的评估方法是通过超数排卵技术采集体内不同发育时期的卵母细胞，采用免疫荧光染色的方法，利用confocal采集图片，检测F0代转基因和非转基因羊卵母细胞全基因组甲基化水平差异，来评估转基因羊生殖健康状况。

发明内容

本发明是要解决现有的转基因羊卵母细胞质量检测方法中存在取材困难，实验周期长的问题，提供一种转基因羊卵母细胞的筛选方法。

本发明转基因羊卵母细胞的筛选方法，按以下步骤进行：

一、采用CIDR+FSH的方法对转基因羊和非转基因羊进行超数排卵，收集不同发育时期的卵母细胞；

二、用体积百分浓度为4％的多聚甲醛固定卵母细胞至少30分钟，然后依次用体积百分浓度为1％的Triton-100处理30分钟、体积百分浓度为1％的HCl处理30分钟、2mg/mL的BSA封闭液封闭30分钟；

三、将卵母细胞经PBS吹洗3次，然后加入一抗，4℃孵育过夜，然后于FITC标记的山羊抗小鼠二抗中37℃孵育1.5h，接着于碘化丙碇中室温染色10min，制片，Confocal显微镜观察并拍照；

四、采用图像分析软件将同一发育时期的转基因羊和非转基因羊的卵母细胞进行荧光强度定量分析比较，选择每个发育时期都满足与非转基因羊卵母细胞相比荧光强度无显著性差异的转基因羊卵母细胞，即完成转基因羊卵母细胞的筛选。

步骤一中所述不同发育时期是指生发泡期(GerminalVesicle，GV期)和减数分裂Ⅱ期(MeiosisⅡ，MⅡ期)。

步骤三中一抗为5-甲基胞嘧啶。

步骤四所述图像分析软件为EZ-C1FreeViewer。

DNA甲基化(DNAMethylation)是真核生物的一种重要的最早发现的表观遗传修饰途径之一。DNA的甲基化修饰有多种方式，主要形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)和少量的N6-甲基嘌呤(N6-mA)及7-甲基鸟嘌呤(7-mG)，其中最易发生和研究最为广泛的是发生在基因组CpG二核苷酸胞嘧啶上的甲基化，DNA甲基转移酶识别CpG二核苷酸，由S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体，在基因组内CpG二核苷酸中胞嘧啶的5位碳原子加上一个甲基基团(5mC)。

哺乳动物一生中DNA甲基化水平经历2次显著变化，第一次发生在受精卵最初几次卵裂中，去甲基化酶清除了DNA分子上几乎所有从亲代遗传来的甲基化标志；第二次发生在胚胎植入子宫时，一种新的甲基化遍布整个基因组，甲基化酶使DNA重新建立一个新的甲基化模式。细胞内新的甲基化模式一旦建成，即可通过甲基化以“甲基化维持”的形式将新的DNA甲基化传递给所有子细胞DNA分子。