[发明专利]一种纯化腺病毒颗粒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒制备领域一种纯化腺病毒颗粒的方法。

背景技术

疫苗制备领域近些年的进展产生了对大规模生产的需求，急需稳定高效的方法来提供足量疫苗。针对一些病的疫苗可以基于重组腺病毒颗粒。目前进行了大量的努力以优化基于细胞的腺病毒制备方法。将细胞进行高密度培养，随后感染以获得更高的总病毒收率。这种在单生物反应器中获得高病毒浓度的收获病毒溶液的方法通常的病毒颗粒(VP)收率为约1.5*1012VP/ml。

以高密度培养细胞的方法易于积累细胞碎片和宿主DNA。纯化过程中必须进一步去除这些。US7326555公开一种从收获细胞培养物中去除宿主细胞DNA的方法。这种方法可以选择性的从细胞培养物中沉淀宿主细胞DNA而不沉淀腺病毒颗粒。然而这种方法只适用于低细胞密度培养液中的腺病毒纯化，未见高细胞密度培养液中沉淀病毒颗粒的应用。由于病毒颗粒数较高，该方法大量使用阳离子去污剂可使得腺病毒大量聚集沉淀，影响收率。当今影响腺病毒纯化的最主要原因是，步骤繁琐，收率低。因此筛选出一种简便、快捷、高效的高密度细胞悬液中纯化腺病毒的方法尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高密度细胞悬液中去除宿主DNA的方法，以及合适的纯化腺病毒的方法。本发明筛选出一套简单可行的高密度细胞悬液中去除宿主DNA的方法，避免了加入阳离子洗涤剂而导致的腺病毒颗粒的聚集沉淀问题和阳离子洗涤剂对后续纯化的影响。

本发明提供一种从包含5*10⁶-150*1⁰6细胞/ml的细胞悬液中纯化腺病毒颗粒的方法，所述方法包括：a)将所述细胞悬液中的细胞裂解并通过离心去除宿主细胞碎片；b)切向流超滤系统浓缩病毒悬液，并去除细胞培养基中相关物质，更换体系为核酸酶最适工作体系；c)添加广谱核酸酶BENZONASE^TM消化宿主DNA；d)SepharoseG25脱盐柱去除核酸酶未消化片段化宿主DNA，在b)、c)及d)3步中可将高密度细胞悬液中的宿主DNA去除达80％以上。

本发明涉及从高细胞密度悬液纯化来自细胞裂解物的腺病毒颗粒的方法。所述高细胞密度悬液通过将细胞培养至高细胞密度而获得，将细胞培养至高细胞密度的方法为本领域技术人员已知。获得高细胞密度培养物的具体方法公开与WO2004/099396及WO2005/095578。用腺病毒颗粒感染高细胞密度培养物以允许所述腺病毒在细胞悬液增殖。感染高细胞密度培养物的方法也是本领域技术人员已知的。获得高病毒浓度的高细胞密度培养物的具体方法公开于EP08168181.9。根据本发明，一旦腺病毒在细胞培养物中增殖并杀死大部分细胞，则从高细胞密度悬液纯化腺病毒颗粒。

裂解及澄清

所述方法第一步包括将细胞悬液中细胞裂解。其中裂解细胞膜的步骤允许从感染的高细胞密度悬液收获细胞相关(胞内)和非细胞相关(胞外)腺病毒。本发明中裂解方法主要为物理方法，此为常规方法。将细胞悬液通过反复冻融3次后进行中空纤维超滤进行机械剪切以释放大量腺病毒。

裂解后存在有大量的宿主细胞碎片及宿主蛋白沉淀。由于本发明所述步骤中没有加入阳离子洗涤剂沉淀宿主DNA的步骤，因此细胞裂解液澄清步骤在裂解后进行。澄清步骤可用死端过滤，切向流过滤，微过滤和离心等来进行。本发明考虑简便性及经济性问题，以及后续步骤中使用的切向流超滤，故选择离心方法。将细胞裂解液进行离心，能够很好的去处细胞碎片及蛋白沉淀。

浓缩

本发明中，澄清的腺病毒颗粒悬液可以通过超滤处理。超滤用于浓缩病毒悬液，去除细胞培养基中的相关物质，去除小部分宿主DNA，并可更换缓冲液为下步酶处理做准备。本领域技术人员了解缓冲液交换发生的条件以及何种缓冲液适用于这一步骤。腺病毒颗粒悬液可浓缩5-20倍。

所选的超滤膜孔径大小应足够小以保留腺病毒颗粒，并在此基础上足够大以有效的清除杂质。这取决于生产商和膜类型。切向流模式的超滤是首选的。本发明采用QuixStand切向流过滤系统(GE)，500KD截留分子量超滤柱(GE)来进行腺病毒颗粒悬液的超滤浓缩与更换缓冲液。所更换的缓冲液为20mMTris-HClpH7.6，10mMMgCl₂，1mMDTT，并严格禁止缓冲液中去污剂及EDTA的存在。

酶处理