[发明专利]一种高效富集微生物的功能化磁性纳米粒子及制备与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，特别涉及一种高效富集微生物的功能化磁性纳米粒子及制备与应用。

背景技术

随着社会进步，食品安全日益受到人们重视，尤其是食品中的致病性细菌对人们的健康产生了严重的威胁。目前主要的检测方法都是通过培养基增菌、平板菌落形态观察来对微生物进行检测，这种方法相对可靠，但也有这明显的不足。培养基增菌、单菌落划分以及鉴定往往需要5天以上的时间，这已经无法满足现在市场高流通性和时效性的需求，无法对食品致病菌的传染进行有效预防。同时，基于菌落形态的检测更是不甚可靠，也需要专业的人士来操作。因此，开发一种能对食品致病菌进行快速、可靠检测的方案显得尤为迫切。增菌往往需要很久的时间，而富集则相反，只需要将一定体系中的病原菌进行有效的集中即可。现在已经出现了多种对细菌的富集方式，主要是通过基于抗体、适配体、抗生素、化学基团等和细菌能特异性结合的方式，但这些方法也都存在着一些问题，比如抗体价格较高且只能识别单一的细菌，同时不方便储存和运输；抗生素比如万古霉素修饰的纳米磁珠会因为修饰作用改变磁珠表面的性质使之在液体中的分散性减弱，对细菌的捕获效率下降；化学基团比如氨基往往是通过电荷作用对表面带负电的细菌进行结合，而这导致了无法有效分离纯化捕获细菌的基因组，致使后续无法对捕获到的细菌进行核酸层面的检测。这些缺陷都导致了目前用于富集的磁珠无法在实际生活、生产中得到有效地应用。因此开发出一种性质稳定、易于储存、运输，能对细菌进行广谱、高效率富集，且不影响后续对细菌基因组进行核酸检测的功能化纳米磁珠具有重要的社会意义和经济价值。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种高效富集微生物的功能化磁性纳米粒子的制备方法。

本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的功能化磁性纳米粒子。该功能化磁性纳米粒子能对食品中的致病性细菌进行高效富集和核酸检测。

本发明的另一目的在于提供一种基于上述功能化磁性纳米粒子对食品中的微生物进行高效富集和核酸检测的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种高效富集微生物的功能化磁性纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：

通过氨基、羧基脱水缩合作用将万古霉素修饰到氨基磁珠上，再用一端羧基活化的聚乙二醇(PEG)对磁珠上剩余的氨基位点进行封闭；即得到能高效富集微生物的功能化磁性纳米粒子。

所述的氨基磁珠为购自天津倍思乐公司的四氧化三铁磁性纳米微球，表面基团:-NH₂，粒径为100～200nm，浓度为5mg/mL，分散于PBS缓冲液中；四氧化三铁磁性纳米微球，其英文全称是Fe₃O₄magnetic nanoparticles，简写为Fe₃O₄MNPs，本发明中MNPs代指Fe₃O₄MNPs；

所述的PBS缓冲液是1×PBS缓冲液，pH值为7.4～7.6；所述的PBS缓冲液的母液为20×PBS缓冲液，pH值为7.4～7.6，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；

所述的一端羧基活化的PEG优选为其分子量是2000～6000；更优选为5000；

所述的一端羧基活化的PEG更优选为单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG-SC)，分子量为5kDa，购自中科院过程工程研究所；

所述的氨基、羧基脱水缩合作用的反应步骤及体系如下：

1)取氨基磁珠，进行磁富集，加入30mM/pH6的MES缓冲液清洗三次并重悬于30mM/pH6的MES缓冲液中；

2)称取万古霉素盐酸盐，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)；

3)将步骤1)中的氨基磁珠和步骤2)中的药品均匀混合并加入30mM/pH6的MES缓冲液，得到混合液，反应；

4)反应完成后，对磁珠进行磁分离，30mM/pH6的MES缓冲液清洗三次，并重悬于30mM/pH6MES缓冲液中，得到修饰上万古霉素的纳米磁珠；

所述的30mM/pH6的MES缓冲液通过如下步骤制备：取30mmol/L的MES，溶解于去离子水中，调pH值为6.0，得到30mM/pH6的MES缓冲液；其中，MES即2-(N-吗啡啉)乙磺酸，购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；