[发明专利]一种用于连接酶反应的新型探针设计方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学及医学检测领域中核酸扩增反应的探针设计方法，具体涉及连接酶介导核酸扩增反应中的探针设计方法及应用。

技术背景

多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)是2002年由Schouten等首先报道的一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的新技术。MLPA的基本原理为：探针和靶序列DNA进行杂交，之后通过连接酶连接、PCR扩增，产物通过毛细管电泳分离，分析软件对收集的数据进行分析后得出结论。在MLPA反应中，扩增每个靶序列都需要一对探针，每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列。这一对探针与靶序列进行杂交后，再用连接酶连接成为一条寡核苷酸链。连接反应高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶序列与探针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链；反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有一个碱基的差别，也会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。连接反应完成后，用一对通用引物扩增连接好的探针，每个探针的扩增产物的长度都是唯一的，范围在130～480bp之间。最后，通过毛细管电泳分离扩增产物，用Genemarker软件进行分析后得出结论。如果检测的靶序列发生点突变或缺失、扩增突变，那么相应探针的扩增峰便会缺失、降低或增加，因此，根据扩增峰的改变就可判断靶序列是否有拷贝数的异常或点突变存在。目前MLPA技术已经应用于多个领域、多种疾病的研究。

连接酶链反应(ligase chain reaction,LCR)由Landegree于1988年首次应用于镰刀形细胞贫血的分子诊断。是继PCR后，新出现的一种更加完善的DNA体外扩增和检测技术，在检测点突变等方面具有独特的优点。合成一对探针A、B，它们完全与靶序列严格互补。经退火与靶序列结合后，A、B间留下一个缺口(nick)，经连接酶连接后成为完整的、与靶序列互补的核苷酸链。如果靶序列中有点突变，探针不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，变性后探针仍是两个。Wu等人又引入PCR的原理，在连接反应后，变性、退火、再连接，少量的靶序列就被扩增出来。Barany于1991年报道了耐热连接酶-Taq连接酶的发现及其在LCR中的应用，为LCR的实用化奠定了基础。实际操作时探针为2对，A、A’和B、B’，分别与靶序列的正负链互补。每次连接反应的产物又可在下一轮反应中当模板，将靶序列以指数形式扩增出来。

MLPA技术及LCR技术均可用于多重检测，通过合理的探针设计，在一次反应中可以同时检测多个靶序列。在采用毛细管电泳对扩增产物进行分离、分析的情况下，同时检测的靶序列可达到45个。多重检测方法有利于提高检测效率，减少模板的使用量，尤其适用于模板量少且待测靶点较多的情况。然而在传统的MLPA、LCR及其他连接酶介导核酸扩增反应中，由于探针的种类和数量较多，常常出现非特异性扩增条带，影响检测结果。本发明在传统的探针结构上进行改进，将线状探针转变为环状探针，可减少非特异性扩增，提高检测灵敏度。

发明内容

本发明提供了一种在连接酶介导核酸扩增反应中探针的设计方法及应用，可有效减少非特异性扩增，避免假阳性。

该探针设计方法适用于MLPA核酸扩增反应，尤其适用于MLPA多重核酸扩增反应，探针结构与设计原理见图1。该方法中需要一对探针对靶序列进行检测，探针的结构中包含了与靶序列严格互补的互补区、调节探针长度的填充区、作为PCR引物的引物区以及与互补区前端或末端的核苷酸(见图1中的A、C区)互补的延伸区(见图1中的B、D区)。延伸区的长度为5～20个核苷酸，与互补区前端或末端的核苷酸严格互补，即A、B区互补；C、D区互补。B区的序列由A区决定；D区的序列由C区决定。PCR引物区的引物序列可以为通用引物或特异性引物。探针中可不包含突变或包含突变，突变碱基在探针中的位置可位于最后一个(当互补区位于探针的3’端时)或第一个(当互补区位于探针的5’端时)。