[发明专利]一种基于表面增强拉曼光谱检测耳聋基因的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物体外诊断技术领域，涉及一种耳聋基因的检测方法，具体涉及一种基于表面增强拉曼光谱检测耳聋基因的方法。

背景技术

耳聋是一种最常见的人类感觉系统缺陷，因其病因复杂、发生率高和治疗困难等原因而长久地困扰着广大患者及其周围人群，极大地影响着人们的相互交流和生活质量。据统计，重度耳聋在新生儿中发生率高达1/800~1/1000（参见：N. Engl. J. Med. 2006, 354, 2151-2164），全世界几乎七千万人罹患55分贝以上的听力减退，70岁以上的人群中超过60%具有至少25分贝的听力减退（参见：Curr. Opin. Pediatr. 2012, 24, 679-686）。

医学界和科研界一直努力探求新的治疗手段，正如恩格斯所说：“社会一旦有技术上的需要，这种需要就会比10所大学更能把科学推向前进。”耳聋基因治疗的研究始于1996年，近十几年来得益于现代分子生物学、基因工程技术的进步，耳聋基因治疗取得了较为飞速的发展。传统检测方法主要有聚合酶链式反应、DNA测序、寡核苷酸探针杂交法等，需要指出的是这些检测方式操作过程繁杂冗长、检测灵敏度较低、仪器设备昂贵，这对于耳聋突变基因的早期诊断和治疗是极为不利的（参见：J. Hum. Genet. 1999, 44, 388-390; J. Hum. Genet. 2005, 117, 9-15; Biosci. Rep. 2008, 28, 49-59）。

表面增强拉曼光谱（Surface-Enhanced Raman Scattering，全文简称：SERS）是在拉曼散射的基础上建立起来的无损分析表征技术。由于其具有谱带窄、分辨率高、水干扰小、灵敏度高等优点，被广泛应用于化学分析、表面催化、食品安全检测、材料科学和生物医学诊断等领域。但是，表面增强拉曼光谱技术能否发展成为一种具有实际应用意义的分析技术，很大程度上取决于表面增强拉曼光谱技术的重现性和稳定性，其中关键之处就是制备出灵敏度高、重现性好、稳定性高、易制备的表面增强拉曼光谱活性基底并能够在实体检测中得到广泛应用（参见：Small 2013, 9, 2493-2499; Nano Today 2011, 6, 122-130）。

目前，现有技术中，尚无关于采用表面增强拉曼光谱对实际体系中耳聋突变基因进行高灵敏特异检测的详细报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于开创性的提供一种基于表面增强拉曼光谱检测耳聋基因的方法。

为实现上述目的，本发明以氢氟酸（HF）浸泡除杂后的单晶硅片，在其表面形成硅-氢（Si-H）键，加入硝酸银（AgNO₃）制得硅表面增强拉曼散射（SERS）基底；将发夹DNA末端巯基（SH基）与银纳米粒子（silver nanoparticles，全文简称AgNPs），使发夹DNA共价连接到AgNPs修饰的Si材料（AgNPs-decorated silicon wafers，全文简称AgNPs@Si）上，老化后，加入待检测耳聋致病基因序列充分杂交进行SERS检测。

具体的，本发明提供如下技术方案：

本发明的基于表面增强拉曼光谱检测耳聋基因的方法，包括下述步骤：

（1）硅片的预处理

将单晶硅片置于超声仪中依次用去离子水、丙酮、去离子水超声清洗，用浓硫酸（H₂SO₄）和过氧化氢（H₂O₂）混合溶液清洗，用氢氟酸溶液浸泡硅片，将硅片平铺于反应器中，光面朝上，向其中迅速加入不同pH值的硝酸银溶液进行反应，得到表面修饰银纳米颗粒的硅片SERS基底；

上述技术方案中，将单晶硅片置于超声仪中依次用去离子水、丙酮、去离子水以60Hz频率超声清洗15分钟。

上述技术方案中，以体积比=3:1的浓硫酸和30%过氧化氢混合溶液清洗硅片30分钟。

优选的，所述氢氟酸溶液的浓度为1~30%；

进一步的，所述氢氟酸溶液浸泡硅片的时间为5~45分钟。

优选的，所述硝酸银溶液浓度为1~5mM，反应时间为5~25分钟。

优选的，用1~30%的氢氟酸溶液或0.001~5M的NaOH溶液调节硝酸银溶液的pH值。

优选的，用氮气吹干表面，得到硅基SERS基底。

（2）组装发夹结构DNA