[发明专利]一种检测小鼠内耳毛细胞的标记分子及应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种小鼠内耳毛细胞鉴定，特别涉及一种组合式细胞标记分子鉴定小鼠内耳毛细胞的新型方法，这种方法能特异性地鉴定分离和培养的小鼠内耳毛细胞。

(二)背景技术

哺乳动物内耳的前庭和耳蜗中存在内耳干细胞，内耳干细胞具有自我更新和多分化多潜能性，体外无血清贴壁培养可以形成内耳祖细胞。将内耳祖细胞与灭活的鸡胚椭圆囊间质细胞共培养，部分祖细胞可以分化成具有功能的成熟毛细胞，具有典型的毛细胞形态。

近年来的研究发现内耳干细胞具有多分化潜能，在特定的分化条件下可以发育成内耳毛细胞。首先，将内耳干细胞接种在经多聚赖氨酸预先处理好的培养皿中，无血清贴壁培养7天。RT-PCR和免疫荧光检测表明分化之后的细胞表达内耳发育相关基因和蛋白，形成内耳祖细胞。然后将内耳祖细胞接种在灭活的鸡胚椭圆囊间质细胞上。7天后，RT-PCR和免疫荧光检测表明诱导分化后有部分细胞表达毛细胞的特异性基因和蛋白。诱导产生的毛细胞可以吸收特异性分子染料FM1-43，全细胞膜片钳检测发现其具有功能。内耳毛细胞是机械刺激的受体，可以将声音刺激转化为电信号。功能敏感性毛细胞的丢失是导致感音性耳聋的主要原因。因此，毛细胞在治疗感音性耳聋方面具有重要的应用价值。

具有大量的纯度较高的细胞是分子和细胞生物学研究的基础。内耳毛细胞在内耳中数目较少；体外培养条件复杂；缺少特异性的表面蛋白，导致分离高纯度的毛细胞难度很大。因此，到目前为止，对毛细胞进行的相关研究还非常少。虽然目前有研究发现了一些不同物种内耳毛细胞表达的基因，但这些基因尚缺乏较强的组织特异性，例如成鼠分离的内耳毛细胞表达的Myosin VIIA，Espin以及Brn3c，在其他的组织中也有不同程度的表达。因此，到目前为止尚缺乏针对内耳毛细胞特异性的细胞标记分子，这对内耳毛细胞的分离和纯化以及鉴定造成了一定的困难，也是内耳毛细胞应用研究方面存在的一个技术瓶颈。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种鉴定小鼠内耳毛细胞的标记分子，并采用这种细胞标记分子特异性地鉴定小鼠内耳毛细胞的方法。本发明是通过分离得到小鼠内耳耳蜗基底膜上的干细胞，在体外进行无血清悬浮培养获得克隆的小鼠内耳干细胞。将内耳干细胞无血清贴壁培养7天，诱导分化形成内耳祖细胞。再将内耳祖细胞接种在灭活的鸡胚椭圆囊间质细胞上共培养，7天后约有30-40％的内耳祖细胞分化成毛细胞。用小分子染料FM1-43特异性标志毛细胞，再通过流式细胞仪进行分选，得到纯度较高的毛细胞。提取小鼠内耳毛细胞的核糖核酸(RNA)进行小鼠基因表达谱芯片检测小鼠内耳毛细胞基因表达谱，然后筛选特异性候选基因。最后从新生小鼠中提取出如大脑、肝脏、皮肤等10个不同组织的RNA，通过RT-PCR对候选的目的基因进行特异性检测，确定小鼠内耳祖细胞的特异性组合式细胞标记分子。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种检测小鼠内耳毛细胞的标记分子，所述的标记分子为Chrna9(核苷酸序列为序列5所示)和Espnl(核苷酸序列为序列6所示)。

本发明还提供一种所述的检测小鼠内耳毛细胞的标记分子在检测小鼠内耳毛细胞中的应用，所述的应用为：从小鼠耳蜗基底膜分离单细胞，提取单细胞总RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，分别以Chrna9正向引物和Chrna9反向引物，Espnl正向引物和Espnl反向引物作为两对引物进行PCR扩增，若Chrna9正向引物和Chrna9反向引物扩增产物355bp，Espnl正向引物和Espnl反向引物扩增产物759bp，则单细胞为小鼠内耳毛细胞；

Chrna9正向引物：5’-AGCTGCGTCTCCAGTCATTC-3’；

Chrna9反向引物：5’-TGCTGTCTCTACGGCTTTGA-3；

Espnl正向引物：5’-GGTGGAGTGGTTACTCCGTG-3’；

Espnl反向引物：5’-GGCATGTGGGCATTTCATCA-3’。

本发明所述检测小鼠内耳毛细胞的标记分子按如下步骤筛选：

(1)内耳干细胞分离和成球培养

解剖小鼠获得小鼠耳蜗基底膜后，将基底膜胰酶消化，用移液枪吹打散后，获得单细胞，然后将单细胞悬浮在内耳干细胞培养基中，在37℃、5％CO₂孵育箱中悬浮培养5-6天，形成内耳干细胞球。

本发明分离培养的小鼠内耳干细胞阳性表达Nestin、Abcg2、Pax-2、BMP-4及BMP-7等基因。