[发明专利]检测艰难梭状杆菌核糖分型027的序列、技术平台及其方法

说明书

本发明有关于检测艰难梭状杆菌(Clostridium difficile)核糖分型027的序列、技术平台及其方法；此技术平台包括有与艰难梭状杆菌核糖分型027具有特异性，可用以进行聚合酶链式反应(PCR)的引物对，以及多重聚合酶链式反应所需的引物组及检测材料；其方法是先取得检体DNA，于活体外以引物组进行扩增检体DNA，再检测检体是否含有符合目标序列SEQ ID NO：1的特征，若符合此特征则表示检体含有艰难梭状杆菌核糖分型027；藉此达到快速确认检体中有无包含核糖分型027菌株的目的。

技术领域

本发明有关于一种检测艰难梭状杆菌核糖分型027的序列、技术平台及其方法，于活体外进行艰难梭状杆菌的流行病学检测与基因分型，尤其指针对检测艰难梭状杆菌核糖分型027特有的目标序列SEQ ID NO：1所设计出的#1与#2引物对，并发展出一个单一步骤、快速且灵敏的技术平台，通过聚合酶链式反应方式，即可检测检体是否具有目标序列的特征，藉此达到快速确认检体中有无包含核糖分型027菌株的目的。

背景技术

由Holdeman于1977年首度发表的艰难梭状杆菌(Clostridium difficile)，属于芽孢杆菌科(Bacillaceae)梭孢杆菌属(clostridium)，其属名来自希腊文，意指梭状物(spindle)，种名源自拉丁文difficile，是艰难的意思，表示其在分离和研究上都比较艰难；艰难梭状杆菌是一种厌氧性革兰氏阳性杆菌，在人体外环境或医疗环境中，会形成孢子体，常透过医疗照护行为而传播。艰难梭状杆菌尚有不同分型的菌株，其具有不同的毒性能力，其中有些亦为人体肠道中的正常菌群(normal flora)之一，由于其他肠道菌的竞争压抑才使其不易致病；但于医院里，有些病患会因为抗生素使用而抑制体内的正常菌群，导致艰难梭状杆菌伺机性感染，引起艰难梭状杆菌大量增生，由于艰难梭状芽孢杆菌主要的致病力来自于分泌的毒素A与毒素B，毒素会引发肠黏膜发炎及受损，因此会引起病人伪膜性结肠炎(pseudomembranous colitis)或严重腹泻等，并可能引起病人败血症，甚至死亡。另外，曾有研究针对医疗机构所爆发艰难梭状杆菌相关疾病的临床菌株进行分析，发现这些类似的菌株皆会分泌一种二元毒素CDT(binary toxin CDT)，并且于其致病基因tcdC上都有缺失(deletion)，如此的基因改变推测与毒素A与毒素B分泌增加相关。

近年来，艰难梭状杆菌感染症(Clostridium difficile infection，CDI)流行病学的改变与一株艰难梭状杆菌核糖分型(ribotype)027流行性菌株的出现有关，已知核糖分型027菌株具有高度毒性，并且由核糖分型027菌株引起的群体性突发事件中，常具有高致死率与高复发率的情形，因此分析艰难梭状杆菌分型将有助于了解其感染症的流行病学信息；现有艰难梭状杆菌首要的分型方法为聚合酶链式反应的核糖分型(PCRribotyping)，然全球却没有一套简易标准化的检测法可遵照。

目前艰难梭状杆菌诊断技术中无法直接以细菌基因分子诊断方式直接判读是否为核糖分型027，必须以传统聚合酶链式反应核糖分型方式，同时对比标准菌株的基因指纹图谱才能获得解答。请参阅图7，为现有艰难梭状杆菌核糖分型检测分析图，以现有方法进行核糖分型分析时，其缺点为需要大量已知核糖分型的菌株作为分型的标准依据，并需要强大的计算机分析，才有办法作标准化分析，实验室的再现性低，具有标准菌株是否购足的限制且程序较为繁琐。

因此，如何发展出可专一性且快速检测艰难梭状杆菌核糖分型027菌株的方式，找到一个特定的基因片段并发展成为单一步骤、快速且灵敏的诊断替代法，便成为此相关领域发明人关注的焦点。

发明内容

发明人即是鉴于上述现有的检测艰难梭状杆菌核糖分型的方法于实际实施使用时仍具有多处缺失，于是本着孜孜不倦的精神，并通过其丰富专业知识及多年的实务经验所辅佐，而加以改善，并据此研创出本发明。