[发明专利]一种大肠杆菌色氨酸酶突变体及其编码基因

权利要求书

1.一种大肠杆菌色氨酸酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由SEQ ID NO.1衍生的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述大肠杆菌色氨酸酶突变体的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.含有权利要求2或3所述基因或权利要求4所述载体的宿主细胞。

6.权利要求1所述色氨酸酶突变体的筛选方法，其特征在于，具体包括以下步骤:

(1)从E.coli JM109基因组DNA中，利用引物扩增色氨酸酶的编码基因；

(2)采用易错PCR技术，以色氨酸酶的编码基因为模板，扩增获得色氨酸酶突变体基因；

(3)将步骤(2)所得易错PCR产物及表达质粒pET28a+用Sac I和Not I双酶切后连接，连接产物转入大肠杆菌BL21感受态细胞，涂布至含卡那霉素的LB平板，将平板置37℃恒温培养箱培养，即得构建好的重组色氨酸酶基因突变库；

(4)LB平板上长出菌落，挑取其中的100个单克隆，转接到LB液体培养基中，37℃摇床培养，待菌液OD₆₀₀长至0.5时，加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导，37℃摇床继续培养2h后，收集菌体，超声破碎，测定色氨酸酶突变体酶活，挑选酶活力最高的一株。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的引物为：

正向引物：5’-GATCGAGCTCATGGAAAACTTTAAACATCTCC-3’；

反向引物：5’-GATCGCGGCCGCTTAAACTTCTTTAAGTTTTGC-3’。

8.权利要求1所述色氨酸酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用引物PCR扩增色氨酸酶突变体基因；

(2)将步骤(1)所得PCR产物连接表达载体pET-28a(+)；

(3)连接产物转入大肠杆菌感受态细胞，获得表达产物。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中所用引物为：

正向引物：5’-GATCGAGCTCATGGAAAACTTTAAACATCTCC-3’；

反向引物：5’-GATCGCGGCCGCTTAAACTTCTTTAAGTTTTGC-3’。