[发明专利]一种禽CCCH型锌指蛋白chZAP及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及动物病毒学和免疫学领域，具体提供了一禽CCCH型锌指蛋白chZAP及其应用。

背景技术

CCCH型锌指抗病毒蛋白(ZAP)是近年新发现的、可特异性降解病毒mRNA的真核细胞抗病毒防御系统中的超蛋白家族成员。ZAP具mRNA结合特性，在RNA病毒感染时，会通过与病毒mRNA3’端或5’端结合使之失去感染性，从而辅助免疫细胞防御外源病毒。由于其自身的结构特点，可以选择性的结合特异的靶结构，使锌指蛋白在基因的表达调控、细胞分化、胚胎发育等生命过程中发挥重要作用。

CCCH型锌指抗病毒蛋白具体而言是含有4个稳定的CCCH结构域，通过结合Zn2+可以自我折叠形成稳定的短的“手指”结构的一类宿主蛋白质。自1985年在爪蟾卵母细胞中发现第一个锌指蛋白以来，如今已在动物、植物、微生物中陆续发现包括CCCH(C：半胱氨酸，H：组氨酸)在内的九类与基因调控有关的锌指蛋白。2002年，Gao等在小鼠细胞内发现了一种CCCH型锌指蛋白，可以直接结合Moloney鼠白血病病毒(MMLV)RNA序列引起mRNA降解，从而抑制病毒在细胞内的复制，因此将此蛋白命名为CCCH型锌指抗病毒蛋白(ZAP)，该蛋白承担了一种细胞内限制因子的作用，限制各类敏感病毒感染。此外，ZAP编码基因是许多干扰素刺激基因(ISGs)之一。这些因子在无干扰素的基础条件下，具有限制病毒复制的能力，因此，在先天免疫途径中起着重要作用。

而禽白血病病毒为RNA病毒，如何结合ZAP的生物学特性，利用ZAP对抗ALV感染有望成为禽白血病高效防控的新途径。

发明内容

针对现有技术中的相关情况，本发明的发明人提供了一种宿主防御蛋白的表达及其在抗禽白血病病毒的应用，具体提供了一种禽防御蛋白chZAP，该蛋白含有4个稳定的CCCH结构域，通过结合Zn2+可以自我折叠形成稳定的短的“手指”结构；具mRNA结合特性，在RNA病毒感染时，会通过与病毒mRNA3’端或5’端结合使之失去感染性，从而辅助免疫细胞防御外源病毒。本发明利用慢病毒载体将chZAP基因转入DF-1细胞的基因组，通过chZAP的过量表达，有效的抑制了逆转录病毒ALV-J的增殖，证实了chZAP的抗禽白血病病毒作用，同时为J亚群禽白血病的防治提供科学基础和技术支撑，降低养禽业因ALV-J感染造成的经济损失。

发明人首先从禽类体内获得了一种禽CCCH型锌指蛋白chZAP，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

该禽CCCH型锌指蛋白chZAP N末端功能区的保守序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

发明人发现该锌指蛋白具有与现有发现的其他物种锌指蛋白相同的功能，可以特异性降解病毒mRNA；

针对上述发现，发明人结合实际情况，提供了一种chZAP慢病毒重组载体，并利用该载体成功的过量表达chZAP，从而可以有效降解禽白血病病毒的mRNA,解决了ALV囊膜区超突变逃逸免疫细胞攻击问题，为禽白血病的高效防治提供了新途径。

该chZAP慢病毒重组载体含有chZAP N末端的基因序列。

其中所述的慢病毒慢病毒重组载体购自吉凯基因公司的过表达慢病毒。

为了获得上述的chZAP慢病毒重组载体，发明人首先首先禽CCCH型锌指蛋白的N末端功能区保守序列设计合成了引物，其正向引物序列为5’-GAATTCAGCTTCCTCACCAAGACCCTC-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，含EcoR1酶切位点，反向引物为5’-GCGGCCGCAGATGGCTTCTGTTCTTTGCTACT-3’，含Not1酶切位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

获得上述引物之后，发明人以正常SPF鸡的肝、脾、肾及DF-1细胞的cDNA为模板进行PCR扩增,结果发现所获得的核苷酸序列完全一致，从而获得chZAP N末端功能区的保守序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。