[发明专利]一种定点突变RNase ZS1获得温敏不育系的方法

权利要求书

1.一种定点突变RNase Z^S1获得温敏不育系的方法，其特征在于：其包括

利用CRISPR/Cas9系统根据RNase Z^S1(Os02g0214300或LOC_Os02g12290)设计靶标序列的步骤；和

构建含靶标序列片段的pU3-gRNA载体的步骤；和

构建含靶标序列片段的pCRISPR/Cas9载体的步骤；和

获得转基因苗的步骤；和

突变位点的鉴定步骤；以及

获得不带转基因成分的温敏不育系的步骤。

2.根据权利要求1所述的定点突变RNase Z^S1获得温敏不育系的方法，其特征在于，所述RNase Z^S1双链片段中的一条链具有以下结构：5’-N_X-NGG-3’，也可以是5’-N_X-NAG-3’或5’-N_X-NGA-3’，N表示A，T，C和G中的任意一个，14≤X≤30。

3.根据权利要求2所述的定点突变RNase Z^S1获得温敏不育系的方法，其特征在于，突变后的特征表现为NGG或NAG或NGA上游第3个碱基与第4个碱基之间插入碱基或在其5’和/或3’丢失碱基。

4.根据权利要求1所述的定点突变RNase Z^S1获得温敏不育系的方法，其特征在于，构建含靶标序列片段的pU3-gRNA载体具体步骤为：首先合成带粘性末端的靶标引物，将接头引物变性后移至室温冷却完成退火；将退火后的引物链接到经酶切后的pU3-gRNA载体上，经PCR扩增和测序验证阳性质粒。

5.根据权利要求1所述的定点突变RNase Z^S1获得温敏不育系的方法，其特征在于，构建含靶标序列片段的pCRISPR/Cas9载体是将含靶位点序列片段的gRNA表达盒从pU3-gRNA上切下，然后链接到含Cas9表达盒的pCRISPR/Cas9载体上。

6.根据权利要求1所述的定点突变RNase Z^S1获得温敏不育系的方法，其特征在于，获得转基因苗的步骤是将含靶标的pCRISPR/Cas9载体转化水稻愈伤组织，经筛选，分化和生根成苗，将转基因植株种植于网室；通过潮霉素鉴定阳性转基因植株。

7.根据权利要求6所述的定点突变RNase Z^S1获得温敏不育系的方法，其特征在于，将含靶标的pCRISPR/Cas9载体转化水稻愈伤组织的方法是通过农杆菌介导的遗传转化或基因枪法。

8.根据权利要求1所述的定点突变RNase Z^S1获得温敏不育系的方法，其特征在于，突变位点的鉴定步骤具体为：提取阳性植株的DNA，并设计引物扩增上述DNA，经纯化后，测序，分析突变情况。

9.根据权利要求1所述的定点突变RNase Z^S1获得温敏不育系的方法，其特征在于，获得不带转基因成分的温敏不育系的步骤具体为：收获T₀代实现定点突变的植株的种子，在长日/高温条件下种植T₁代植株，通过表型观察和潮霉素阳性检测分离到不带转基因成分但表型不育的植株种植于短日/低温条件下，育性恢复可育的植株作为温敏不育株，经繁殖后获得温敏不育系。