[发明专利]一种促血管生成的温敏性水凝胶粉及用其制备的温敏性水凝胶

说明书

技术领域

本发明涉及一种温敏性水凝胶粉及用其制备的温敏性水凝胶，属于生物材料领域。 

背景技术

水凝胶(Hydrogel)是以水为分散介质的凝胶，具有接近正常组织的含水量及良好的生物相容性，理化性质可控，具有多孔结构，其立体多孔结构跟细胞外基质很相似，有利于细胞生长增殖分化，也有利于生物活性因子活性的保持，可微创植入，在组织工程中具有广泛应用前景。 

温敏性水凝胶可在体温范围内从液态转变为凝胶态，不需其他催化剂及剧烈的反应条件，能修复各种不规则形状的组织缺损，能将细胞或者活性物质均匀的分布在缺损部位，促进细胞生长、胞外基质的分泌和组织的自我修复，在组织工程应用中具有突出的优势。 

细胞外基质凝胶制备方法包括尿素抽提法和酶(通常为胃蛋白酶)消化法。尿素抽提法在尿素抽提之前，通常用酶(如中性酶)处理新鲜组织块以去除组织中的细胞成分，然后加入蛋白酶抑制剂匀浆，离心去上清，重悬于尿素缓冲液中，过夜处理，离心去上清，将pH值由7.4降为4.0或在37℃孵育，均可形成凝胶，但是pH诱导凝胶化要比温度诱导凝胶化迅速。酶消化法一般是用胃蛋白酶在盐酸(0.1N或者0.01N)酸性条件下消化ECM或dECM干粉末，使其成无可见微粒的均一粘稠的液状物体，然后于冰上加等摩尔量的NaOH碱液中和，然后加九分之一的10×PBS，即成液态的原凝胶(pre-gel)，37℃孵育后形成固态的凝胶(gel)。酶消化法相比尿素抽提法，省去了纯化步骤，避免对细胞外基质成分过多的损失，是目前应用比较多的制备细胞外基质水凝胶的方法。 

现有的细胞外基质制备技术，是以细胞外基质制备成碱液中和前的酸性消化液作为成品，临用前，将酸性消化液与碱液中和使用，如市售I型胶原温敏凝胶成品即为鼠尾I型胶原醋酸溶液。然而，因消化液为液体，保存困难，必须-20℃存放，在4℃仅可保存两个月，储存条件苛刻，运输成本高，难以大规模生产和投入市场大量使用。另外，因为消化液为液体形式，较为粘稠，因此其灭菌困难，通常采用有机溶剂进行灭菌。如制备猪、人去细胞的温敏凝胶，将中合后的溶液对氯仿透析过夜，然后透析去除氯仿，灭菌过程费时费力【Poon,C.J.；Pereira,E.C.M.；Sinha,S.,et al.Preparation of an adipogenic hydrogel from subcutaneous adipose tissue.Acta Biomater,2013,9(3): 5609-5620】。 

需要提供一种新的制备水凝胶的方法，克服前述消化液存放难，灭菌难的问题。 

人胎盘富含细胞外基质及基底膜，通常于产妇分娩后丢弃，易于获得对供体无损伤。胎盘含有丰富的各种生物学成分，包括激素、细胞因子、趋化因子及生长因子(如肝细胞生长因子、表皮生长因子、TGF-α、TGF-β等)，这些因子大多以自分泌或旁分泌形式发挥作用，调节其他生物活性物质的产生，已有研究表明胎盘提取物刺激组织修复过程，可能具有治疗潜力。胎盘被用于促进伤口愈合，补充生命体质，协助治疗皮肤癣、类风湿关节炎及其他疾病。人胎盘提取物含有丰富的活性生物因子。水溶性人胎盘提取物在许多国家被批准术后敷料、烧伤及慢性溃疡，甚至被批准用于肝病治疗。但其确切机制尚未完全阐明。动物实验表明：人胎盘提取物通过降低肝纤维化，诱导肝再生，调节炎性反应，从而可能用于治疗肝脏疾病。2006年Tae-beom SEO等报道人胎盘提取物通过上调神经再生相关蛋白如轴突生长相关蛋白GAP-43和细胞骨架相关蛋白Cdc2而促进SD大鼠坐骨神经损伤的轴突再生。 

将胎盘脱细胞并作为生物材料的研究极少。2002年，美国华盛顿大学修复外科Richard A.Hopper和加拿大多伦多大学化学工程及应用化学系K.Woodhouse等报道采用灌注方法对新鲜人胎盘进行了脱细胞处理。2006年-2009年，加拿大多伦多大学Lauren Flynn等报道人胎盘脱细胞基质能促进前体脂肪细胞的黏附。其进一步研究表明：将脱细胞人胎盘基质与透明质酸构建复合材料促进人脂肪干细胞向脂肪细胞分化。动物实验结果表明单纯胎盘脱细胞基质、透明质酸及其复合支架材料均促进脂肪组织再生，胎盘脱细胞基质有助于维持其植入后体积。Ji Suk Choi等将冷冻干燥的脱细胞人胎盘海绵用于治疗大鼠全层皮肤缺损，结果表明该材料可促进血管内皮细胞、角质细胞的迁移及血管化，进而促进创面修复。上述研究均采用新鲜人胎盘作为原料，但临床使用的胎盘均需要进行系列血清学检测以排除疾病传染的风险，在此过程中，胎盘需冷冻保存。国内外均无冷冻后人胎盘脱细胞用于制备水凝胶的研究。 

发明内容