[发明专利]饮用水源水中肠道病毒的检测方法

权利要求书

1.饮用水源水中肠道病毒的检测方法，包括以下步骤：

（1）水样处理：用无菌采样瓶收集水源水样，将1%体积比的Earle′s平衡液加入水样中以促进病毒的吸附，充分混匀，用1mol/L盐酸调pH为4.5；

（2）水样浓缩：将一张直径175mm的滤纸平铺于175mm直径的过滤器网板上，用无菌水浸湿，将滑石粉-硅藻土混悬液倒在浸湿的滤纸上，加压抽滤，使之形成均匀而平整的薄层，然后盖上两张直径相同的滤纸，将处理好的水样加到吸附层上加压过滤，待水样全部通过吸附层后，用30mL的3%牛肉浸膏洗脱液洗脱吸附层上的病毒，抽滤，收集洗脱液，用1mol/L盐酸调pH至7.2左右，用0.22μm 的微孔滤膜抽滤除菌，得到水样浓缩液，置4℃冰箱待用；

（3）细胞培养：将长成单层的Hela细胞生长液倒掉，加入适量的EDTA-胰酶消化液消化，加入适量的生长液，用吸管吹打分散细胞，再用生长液稀释并分装于细胞培养瓶中，37℃培养；

（4）病毒检测：细胞成片后，弃去生长液，加水样浓缩液，37℃吸附1-2小时，每隔15分钟振荡一次；将接种过的细胞倒掉水样液，加适量的46℃-47℃营养琼脂平铺待凝，凝固后37℃翻转培养48小时，然后用甲醛液固定20分钟，甩掉琼脂，自来水冲洗干净，再加入结晶紫染色20分钟，自来水冲洗，观察空斑并计数，设一瓶空白对照，即细胞不经接种做空斑试验；通过空斑数量计算病毒浓度。

2.如权利要求1所述的饮用水源水中肠道病毒的检测方法，其特征在于所述的Earle′s平衡盐液配制方法为A液：取氯化钠6.8g、氯化钾0.4g、硫酸镁0.2g、磷酸二氢钠0.125g、葡萄糖1g、碳酸氢钠1g溶于800mL二次蒸馏水中，B液：氯化钙0.2g溶于150mL二次蒸馏水中，使用时将B液加到A液中搅拌均匀，4℃保存。

3. 如权利要求1所述的饮用水源水中肠道病毒的检测方法，其特征在于所述的滑石粉-硅藻土混悬液配制方法为取滑石粉2.7g、硅藻土0.9g加入100mL二次蒸馏水中混匀后室温或4℃保存。

4. 如权利要求1所述的饮用水源水中肠道病毒的检测方法，其特征在于所述的生长液配制方法为取浓度为1.04%的1640培养液90mL、小牛血清(灭活)10mL、双抗液1mL混匀后4℃保存。

5. 如权利要求1所述的饮用水源水中肠道病毒的检测方法，其特征在于所述的EDTA-胰酶消化液配制方法为取胰蛋白酶2.5g、EDTA 0.3g、氯化钠8.0g、氯化钾0.4g、葡萄糖1.0g、碳酸氢钠0.5g，0.22μm微孔滤膜抽滤除菌，-20℃保存。