[发明专利]四翅滨藜细胞色素P450基因克隆及其应用

说明书

技术领域

本发明属植物基因工程技术领域，尤其涉及使用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae INVSc1菌株表达与植物抗逆(具体为盐和干旱)相关的蛋白AcCYP450，同时采用实时荧光定量PCR(实时PCR，Real-Time-PCR，)的方法来研究该基因对非生物胁迫NaCl和PEG的功能。

背景技术

目前农业生产中逆境胁迫是影响粮食产量最重要的因素和挑战之一。农作物在整个生长季节中，会受到各种逆境因素的影响，如生物胁迫的病虫害等，及非生物胁迫的盐、碱、高温、低温、干旱等，这些胁迫限制了植物的生长发育，最终会导致作物产量降低，品质下降，直接影响甚至威胁到粮食安全，在这些严重影响作物生产的逆境因子中，极端温度、干旱、高盐、营养失调(包括矿物质中毒和矿物质缺乏)是影响作物产量的主要限制因子，每年直接从盐、碱、干旱、低温胁迫等逆境造成的农作物减产仍然超过总产量的20％，而干旱和盐胁迫是最主要的制约因素。因此，研究与非生物胁迫有关的基因，并将其导入作物进行分子育种，引起了科研工作者的广泛兴趣，而通过基因工程的方法进行逆境相关基因的克隆及其功能的解析，能够为植物抗逆育种提供有价值的信息和材料。然而，从直接解决农业生产中关键问题的角度来看，在农业生产上能起显著作用的转基因作物种类还不多，人类对植物逆境适应性分子机理的研究还远远不够，远不能满足植物分子育种的需求，同世界发达国家相比，我国拥有自主知识产权和具有重要利用价值的基因相对较少。同时，目前的研究也主要集中在草本植物，而对木本植物及其耐盐和干旱的分子遗传研究也相对较少。然而，草本和木本植物在结构、生长、发育、生理，及在应对生物和非生物胁迫等方面存在较大的差异性。所以，从木本植物中寻找抗逆相关的基因并进行研究，能够为通过基因工程提高作物的生物和非生物胁迫耐受性这种手段提供更多的候选基因。

四翅滨藜(Atriplex canescens[Pursh]Nute)是一种盐生灌木，在分类上为藜科，滨藜属，普遍存在于干旱、半干旱地区，具有较强的耐干旱、抗盐碱、耐寒冷和耐重金属的特性，尤其是耐干旱和盐特性。四翅滨藜在每年降雨量≥180mm的干旱半干旱地区，年平均气温仅为5℃左右的低温地区，甚至在极端低温为-40℃地区以及盐碱地等恶劣环境下依然生长良好，同时在海拔2000米左右的地区也适合生长，根据已有报道，四翅滨藜被有些国家称为“生物脱盐器”，它一年时间就可以从6.07亩的土地上吸收到1吨以上的盐分，灌木生物量也能达到15t/hm²，枝叶中的粗蛋白含量在12％以上，高产优质、富含营养，相关科学家们认为，四翅滨藜有及其丰富的营养价值和可观的饲料用途，因此成为了荒漠、半荒漠干旱地区非常有价值的优良饲料灌木树种。同时，四翅滨藜还具有积累硒的能力，因此在美国也广泛用于水土保持和路坡固定，但牧场改良仍然是其主要用途。近年来，四翅滨藜先后在中国的新疆，甘肃，宁夏，青海和其它地方种植，通过大量研究，充分体现了四翅滨藜较强的抗盐，碱，干旱，低温，贫瘠等优良特性，渐渐成为绿化和水土保持的优良树种。

酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)具有典型的真核系统，是二倍体，它在蛋白翻译后加工过程中能形成二硫键，具有糖基化以及蛋白折叠等特征，使得其基因表达模式更加接近于真核植物中的表达模式，它还具有生长快速、遗传操作简便和易于培养等的优点，所以在对植物功能基因的相关研究中，用酵母表达系统筛选具有原核表达系统不可替代的优势性。酿酒酵母菌株INVSc1(基因型为MATa his 3D1 leu2 trp1-289 ura3-52)是经过人工改造后的尿嘧啶营养缺陷型菌株，该菌株的酵母转化子运用SC-U缺培养基筛选时，假阳性低，转化效率高，因此是理想的酵母表达菌株。利用酵母营养缺陷型菌株对植物cDNA文库的研究和挖掘，在植物中受到越来越多关注。Frommer等和Hsu等(1993年)在筛选拟南芥cDNA文库中克隆到氨基酸透过酶的NAT2/AAP1基因，该基因可以互补酵母的氨基酸转运缺陷突变体；酵母系统研究植物耐盐性表达基因的功能研究也被广泛应用，Yamada等(2002年)就利用酵母转化子来验证丙二烯环化氧化酶(AOC)基因可以大大提高抗盐性，进一步推测到AOC基因在植物中也可能具有抗盐功能。唐玉林等(2007年)利用酵母研究了大豆SALI3-2蛋白可以使酵母转化子的耐盐能力得到显著提高，从而推测SALI3-2基因所具有的抗逆能力。由此可见，利用酵母表达外源蛋白并研究其功能已经受到广泛应用。