[发明专利]杂交瘤细胞株FQ-E7，其产生的抗吡虫啉单克隆抗体及应用

说明书

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞株FQ-E7，其分泌的抗吡虫啉的单克隆抗体及应用。

背景技术

吡虫啉属于新型烟碱类杀虫剂，中等毒性，通过作用于昆虫体内的乙酰胆碱酯酶受体而使害虫死亡。吡虫啉可有效防治蚜虫、飞虱、叶蝉等农业害虫，在农业生产中得到了广泛的应用。但是由于农药的不合理与不规范的使用，在防治农业害虫的同时，对环境卫生、人体健康和一些非靶标生物带来了严重的威胁。因此，建立环境中的吡虫啉残留的快速检测方法显得越来越重要。

目前，农药的残留检测多采用薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等方法。这些方法的检测限低、灵敏度高，已有相关的技术标准可供参考，但由于需要昂贵的仪器、专门的操作人员，以及样品前处理复杂、成本高、时间长，因此不能更好地满足快速简便的现场检测要求。

免疫检测方法具有快速、廉价、简便、特异的优点，可便携而进行现场监测。克服了传统检测方法的缺点。要建立免疫检测方法，特别是针对农药小分子的免疫检测方法，筛选出高效单克隆抗体最为关键。本发明即为实现环境与农产品中吡虫啉的免疫检测方法，化学合成针对吡虫啉的多种半抗原，与载体蛋白结合成为免疫原或包被源，并筛选出能够分泌针对吡虫啉的高效单克隆抗体的杂交瘤细胞株FQ-E7。并利用该杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体建立了针对环境与农产品中吡虫啉的免疫金标试纸条检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供杂交瘤细胞株FQ-E7，其分泌的抗吡虫啉的单克隆抗体及应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

1.本发明提供的杂交瘤细胞株FQ-E7，已于2014年6月12号保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是：中国，武汉，武汉大学；保藏编号为CCTCC NO.C2014107。

2.抗吡虫啉单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCC NO.C2014107的杂交瘤细胞株FQ-E7分泌产生。

3.上述杂交瘤细胞株FQ-E7，是通过以下方法筛选得到：

3.1人工抗原的合成

通过化学合成手段合成吡虫啉半抗原：1-[6-(2-羧乙硫基-3-吡啶)甲基]-N-硝基-2-咪唑啉亚胺(H1)和1-(6-氯-3-吡啶甲基)-3-羧丙基-N-硝基-2-咪唑啉亚胺(H2)。利用活泼酯法将具有羧基末端的半抗原偶联到大分子蛋白质上(BSA或者OVA)。其中H1-BSA作为免疫原，H2-OVA作为包被源。

3.2杂交瘤细胞株的筛选

以100μg每只的抗原量免疫6-8周龄健康的雌性BALB/C小鼠。每次间隔时间为2-3周，最后一次加强免疫后3天，无菌条件下取出小鼠脾细胞，将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞以5∶1的细胞数量用PEG介导的方法融合。融合后置于37℃、5％CO2培养箱中培养。培养细胞长至培养孔1/3-1/2时，用间接竞争ELISA法筛选出效价高、抑制率高、细胞生长旺盛的培养孔进行亚克隆。经过3-5次亚克隆后，扩大培养，建立杂交瘤细胞株。

3.3单克隆抗体的制备

将获得的杂交瘤细胞株FQ-E7注射预先用无菌石蜡油处理过的BAlB/C小鼠，收集该小鼠的腹水，利用辛酸-硫酸铵法对收集的腹水进行纯化处理得到抗吡虫啉单克隆抗体。

4.半定量化检测吡虫啉的三通道免疫层析试纸条，包括纸板，纸板的一面从上到下一次黏贴吸水垫、检测垫、金标垫、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜自上而下设置横向质控线、检测线I、检测线II和检测线III。所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述检测线I、II和III分别包被有吡虫啉半抗原-鸡卵清白蛋白；所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的抗吡虫啉单克隆抗体，所述的抗吡虫啉单克隆抗体为由保藏编号为CCTCC NO.C2014107的杂交瘤细胞株FQ-E7分泌产生的。

有益效果

(1)本发明提供的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体稳定性高：杂交瘤细胞冻存于液氮至少保持5年，抗体的稳定性也会比较好，纯化的抗体-20℃冰箱至少可以存放2年。

(2)本发明提供的单克隆抗体灵敏度高：本发明提供的抗吡虫啉单克隆抗体对检测溶液中吡虫啉的最低检测限可达2ng/mL。