[发明专利]一种松树蜂特异性SS-COⅠ引物对及快速分子检测方法

权利要求书

1.一种松树蜂特异性SS-CO Ⅰ引物，其特征在于，其序列如下：

SNSSF1：5’-ATT CTG ACT CCT TCC TCC TGC TTT-3’

SNSSR1：5’-AGT GAT TGC TCC AGC AAG AAC A-3’。

2.一种松树蜂分子检测方法，其特征在于，利用权利要求1所述的松树蜂特异性SS-COⅠ引物对松树蜂及其他与松树蜂同域发生和同属近缘的树蜂类昆虫DNA进行PCR扩增，以检测松树蜂品种；松树蜂SS-CO Ⅰ特异性引物扩增体系的建立包括如下步骤：

步骤一、昆虫基因组DNA的提取；

步骤二、树蜂CO Ⅰ基因序列的通用引物扩增；

步骤三、近缘种多重序列对比及种特异性引物设计；

将步骤二所得通用引物扩增后的PCR产物进行双向测序，得到SS-CO Ⅰ引物序列，使用DNAstar对序列进行拼接，去除冗余序列，将序列结果在GeneBank中进行Blast序列比对；

根据5种树蜂的测序结果以及数据库中已公开的10种Sirex属树蜂的碱基序列进行对比分析，运用软件Primer Primer5.0软件设计松树蜂特异性SS-CO Ⅰ引物：

SNSSF1：5’-ATT CTG ACT CCT TCC TCC TGC TTT-3’

SNSSR1：5’-AGT GAT TGC TCC AGC AAG AAC A-3’；

步骤四、松树蜂SS-CO Ⅰ特异性引物扩增体系的建立优化；

PCR扩增反应使用GreenMaster Mix试剂盒，除采用SS-CO Ⅰ特异性引物外，反应体系与CO Ⅰ基因序列扩增体系相同，扩增的程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，53℃复性30s，72℃延伸1.5min，35个循环；最后72℃延伸10min，每次反应用无菌蒸馏水做一个空白对照，用以排除系统误差，取3μl产物上样到1.5％TAE琼脂糖凝胶上，经130V电泳20min后，将胶块浸泡于EB染料中3min，在紫外分光光度计下检测拍照。

3.根据权利要求2所述的松树蜂分子检测方法，其特征在于，所述步骤一的具体操作步骤为：

(1)将在纯酒精中浸泡的标本用超声波仪器清洗干净晾干后，成虫去头和鞘翅，幼虫取其腹部组织；取＜50mg的组织于研钵中充分研磨，置于1.5ml的离心管中；

(2)向离心管中加入350μ l 的Buffer ITL与25μ l 的25mg/ml蛋白酶K，充分混匀后置于60℃恒温水浴锅两个小时直到组织完全被消化；

(3)在离心管中加入350μl按体积比氯仿：异戊醇＝24:1的混合液缓慢混匀，在室温，10,000转速下离心2min，并小心的将上清液转移到新的干净的1.5ml离心管中；

(4)加入1倍体积的Buffer BL与5μl的RNase A,缓慢混匀，70℃水浴半小时；

(5)室温下加入1倍体积的无水乙醇，缓慢混匀；

(6)将前一步的溶液和絮状沉淀700μl 加入吸附柱内，吸附柱安放于收集管内，10,000×g室温下离心1min，移除废液，吸附柱重新置于收集管内；如此时仍有剩余混合液则重复离心；

(7)将吸附柱重新置于新的收集管内，加入500μl的Buffer KB，10,000×g室温下离心30s，移除废液，吸附柱重新置于收集管内；

(8)加入600μl的DNA Wash Buffer，10,000× g离心30s，移除废液，吸附柱重新置于收集管内；

(9)重复第8步，将吸附柱置于新的收集管内，在吸附柱的盖子打开的条件下，13,000×g室温离心2min，后置于室温下数分钟，使酒精充分挥发；

(10)将吸附柱置于新的1.5ml离心管中，向吸附柱中间部位悬空加入30μl的ElutionBuffer，Elution Buffer在60℃—70℃条件下预热，室温放置2分钟，在13,000×g下离心2min；

(11)重复第10步，以便提高产量。

4.根据权利要求2所述的松树蜂分子检测方法，其特征在于，所述步骤二及步骤四中，PCR扩增反应体系为：使用GreenMaster Mix试剂盒，总体系为25μl，包括：2×GOTaq GreenMaster Mix 12.5μl、两种引物各1μl、DNA模板1.5μl、ddH₂O 9μl。