[发明专利]基因编码的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸荧光探针及其制备方法和应用

说明书

本申请是申请号201110288807.6，申请日为2011年9月26日，名为“烟酰胺腺嘌呤二核苷酸基因编码荧光探针及其制备方法和应用”的发明专利申请的分案申请。母案的全部内容在此通过引用全文纳入本文用于所有目的。

技术领域

本发明涉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的检测探针，具体涉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的重组荧光融合蛋白检测探针。在一个具体方面，本发明涉及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的重组荧光融合蛋白检测探针；在另一个具体方面，本发明涉及氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的重组荧光融合蛋白检测探针；在又一方面，本发明涉及还原型和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸比率的重组荧光融合蛋白检测探针。本发明也涉及上述检测探针的制备方法及其分别在检测NADH、NAD+和NADH/NAD+比率中的应用。

背景技术

NAD⁺及NADH作为辅酶，是呼吸链的重要组成部分，它参与了呼吸链中的电子传递过程(Rich,P.R.等，Biochem Soc Trans.2003，V.31(6)，pp.1095-1105)。在呼吸链的氧化还原反应中，NAD⁺作为质子的载体，当其接受了其他分子传递过来的一个电子后，由最初的氧化态转变为还原态，该反应的最终产物为NADH，而NADH可以作为还原剂向其他分子提供电子(Belenky,P.等，Trends in Biochemical Sciences.2007,V.32(1),pp.12-19)。近来的研究表明，NAD(H)不仅参与能量代谢、物质合成以及抗氧化作用，还涉及到体内的钙稳态、基因表达、免疫作用以及细胞衰老与死亡等等，而NAD(H)在其中均有着至关重要的作用，因此NAD(H)本身及其代谢所涉及的众多酶类也成为了药物设计的靶标(Sauve,A.A.等，J Pharmacol Exp Ther.2008,V.324(3),pp.883-893)。

但是，大多数活细胞内的NAD(H)的总量大约为10^-6M～10^-3M，而且NAD⁺/NADH的比例也随着细胞内状态不同而不尽相同(Lin,S.J.等,Current Opinion in Cell Biology.2003,V.15(2),pp.241-246)，因此这给NAD(H)的测定带来了极大的不便。较早的检测方法主要是利用NADH在340nm紫外光区有特征吸收，由此建立了紫外分光光度法，该方法存在两个主要的缺陷：1、有效灵敏度受仪器精密度所限，约为10^-7M；2、在复杂体系中，不能有效地区分NADH与NADPH。随后，根据NAD⁺作为辅酶，在电子传递过程中接受电子转变为NADH的特性，发展出了一系列酶学检测方法。其他如HPLC分析、电化学法、毛细管电泳、荧光成像等方法也常见诸于各种文献报道中。然而，大部分的方法或者对单个细胞中靶标分子的灵敏度不足，或者不能进行亚细胞器定位。特别需要指出的是，这些现有方法均存在一个主要的缺陷，即需要对样品进行裂解、分离、纯化等操作，而NADH本身又极易氧化，在一系列繁琐的操作中极易将误差引入，导致最终显示的结果与实际存在出入。另外，这些现有方法不能应用于活体动物或细胞，不能进行实时地检测，这限制了这些方法在临床疾病诊断及药物前体研究等邻域的应用。目前在活体或细胞上只能采用NADH自发荧光来检测(Zhang,Q.H.等，Science.2002，V.295(5561)，pp.1895-1897)，而这种传统方法存在以下严重缺陷：首先，已知细胞对NAD⁺/NADH和NADP⁺/NADPH的调控是相对独立的，正常状态下NAD⁺/NADH的比例大约在700:1，而NADP+/NADPH的比例在1:200；其次，它们的氧化还原势存在着巨大的区别，这反映出NADH与NADPH分别在能量代谢与合成代谢中扮演截然不同的角色；第三，NADH与NADPH自发荧光完全不可区分，利用自发荧光进行成像测量获得的结果是NADH与NADPH之和，鉴于NADH含量很低且大部分以蛋白质结合形式存在，所以NADH自发荧光数据实质反映的是蛋白质结合的NADPH的浓度(Zhang，Q.H.等，Science.2002，V.295(5561)，pp.1895-1897)；第四，由于NADH激发波长位于紫外区(340nm)且自发荧光较弱，需要复杂昂贵的仪器如用于临床监测的仪器CritiView，再加上紫外光对组织的穿透力很弱并会造成细胞损伤，这些光学特性严重制约了自发荧光监测的应用。