[发明专利]一种甲基立枯磷胶体金快速检测试纸条及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于农药残留免疫分析技术领域，具体涉及一种甲基立枯磷胶体金快速检测试纸条及其制备方法。

背景技术

甲基立枯磷(Tolclofos-methyl)是一种广谱的有机磷杀虫剂，用于防治贮藏谷物中的害虫和各种叶类作物上的害虫，也用来防治蚊成虫、蝇类、水生幼虫和卫生害虫。其作用机理是抑制乙酰胆碱酯酶的活性。乙酰胆碱是神经递质，过量的乙酰胆碱过度刺激乙酰胆碱受体，导致靶生物死亡。然而，一些不是预定目标的生物也遭到了毒害，包括人、鱼等其他生物。

目前，对农药残留的检测方法主要是仪器分析方法和酶联免疫分析方法(ELISA)等。仪器分析方法包括高效液相色谱法(High performance liquid chromatography，HPLC)、气相色谱法(Gas chromatography，GC)、薄层色谱法(Thin layer chromatography，TLC)、液-质串联法(HPLC-MS)和气-质串联法(GC-MS)等，这些仪器分析方法虽然可以达到较高的检测灵敏度，但需要复杂昂贵的仪器设备及专业操作人员，加之样品前处理繁琐费时、检测费用高，难以满足快速、在线检测的需要。ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)方法是常用的免疫检测方法，但是其却有操作步骤相对较多，检测时间较长，检测结果不够直观，不能在线进行检测等缺陷。因而ELISA方法的应用受到很大的限制。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的第一个技术问题是提供了克服上述甲基立枯磷快速检测技术的不足，研制出一种特异、敏感、快速、简便的甲基立枯磷胶体金快速检测试纸条。本发明所要解决的第一个技术问题是提供了上述试纸条的制备方法。

技术方案：本发明提供的技术方案是一种甲基立枯磷胶体金快速检测试纸条，所述试纸条含有衬板和依次排列在衬板上的样品垫、金标结合垫、纤维素膜和吸水垫，所述衬板为不吸水的韧性材料，所述的韧性材料用硬质塑胶条或不吸水硬纸条制成，所述金标结合垫内吸附有甲基立枯磷金标抗体，所述纤维素膜上有隐形检测线和隐形对照线，所述隐形检测线用甲基立枯磷半抗原偶联的载体蛋白溶液印制，所述隐形对照线用兔抗鼠IgG抗体印制。所述吸水垫为吸水能力较强的吸水滤纸或滤油纸。

其中，上述甲基立枯磷金标抗体为胶体金标记的甲基立枯磷单克隆抗体。

其中，上述偶联甲基立枯磷半抗原的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、鸡卵清白蛋白OVA或人血清白蛋白HAS中的一种或几种。

在试纸条的吸水垫上设有手柄端保护膜，在样品垫上设有样品浸入端保护膜。所述的保护膜为不透明的胶膜，样品垫、金标结合垫对应的保护膜上印制有待测样品标记线，该标记线偏向样品垫一侧约0.5厘米处。

其中，上述样品垫用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜中的一种或几种制成。

其中，上述纤维素膜为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜中的一种或几种。

上述甲基立枯磷胶体金快速检测试纸条的制备方法包括以下步骤：

1)甲基立枯磷半抗原的合成；

2)甲基立枯磷半抗原与载体蛋白偶联得到甲基立枯磷半抗原偶联的载体蛋白溶液；

3)甲基立枯磷金标抗体的制备；

4)金标结合物垫的制备；

5)兔抗鼠IgG抗体的制备；

6)甲基立枯磷半抗原偶联的载体蛋白溶液和兔抗鼠IgG抗体包被纤维素膜；

7)试纸条的组装。

上述步骤1)甲基立枯磷半抗原的合成方法如下：

①O-甲基-O-(2,6-二氯-对-甲苯基)硫代磷酰氯的合成：称取2,6-二氯对甲酚3.7g用乙腈溶解；常温下，将溶液逐滴加入20mL乙腈溶解的O-甲基硫代磷酰氯3.83g、粉状K₂CO₃8.7g混合溶液，滴完后，继续反应1小时，反应完毕后真空过滤，蒸去溶剂，得黄色油状物，柱层析，用石油醚/二氯甲烷洗涤，蒸去溶剂得淡黄色油状液体6.3g；

②甲基立枯磷半抗原：O-甲基-O-(2,6-二氯-对-甲苯基)-N-(丁酸)硫代磷酸酯的合成：称取4-氨基丁酸0.54g、KOH0.78g，溶解于6mL甲醇中，冰水浴冷却至0-10℃，搅拌下缓慢加入溶解于6mL甲醇溶液的步骤①得到的淡黄色油状液体1.18g，保温反应2小时，反应完毕后，用石油醚/乙醚洗涤，水层调pH＝3.0后用乙醚提取，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂，得浅黄色油状物O-甲基-O-(2,6-二氯-对-甲苯基)-N-(丁酸)硫代磷酸酯0.9g。