[发明专利]适用于扩增子测序文库构建的引物及扩增子测序文库的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及高通量测序领域，具体而言，涉及一种适用于扩增子测序文库构建的引物及扩增子测序文库的构建方法。

背景技术

扩增子测序是对特定长度的PCR产物或者捕获的片段进行测序，主要包括16S rDNA测序、18S rDNA测序、ITS测序及功能基因检测等。采用Illumina MiSeq第二代高通量测序平台测定的16S/18S/ITS某个高变区域的序列，来反应环境样品在细菌、真菌、古细菌分类方面物种之间的差异，对研究海洋、土壤、肠道粪便等环境中的微生物构成有重要的指导作用；同样，也可通过对某些功能基因片段的测序，挖掘更多的生物学信息。

16S rDNA为编码原核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列，采用MiSeq测序仪，对16S rDNA某个高变区进行测序，以进一步对环境微生物中的细菌或古细菌的多样性进行分析。

为完成16S rDNA的测序，首先需要基于Illumina测序仪进行相应的文库构建，目前基于Illumina测序平台的建库方法主要有两种，包括两步扩增建库方法以及一步扩增建库方法。第一种建库方法为较早的建库方法，为两步扩增建库，即使用两对引物进行两轮PCR进行建库。第二种方法为Illumina官方推荐的一步扩增方法，该方法目前使用比较广泛，即通过一步扩增完成建库过程。

上述两种建库方法中，两步扩增方法虽然可以直接使用Illumina Miseq相配套的试剂进行测序，但建库过程中需要经过两次扩增，步骤较为繁琐，且经过两次扩增引入的污染较多，使得后续信息分析准确度降低。一步扩增方法虽然可以较为方便地通过一步PCR扩增完成建库，但该方法在进行上机测序时，不能使用Illumina Miseq相配套的试剂进行测序，需要自定义目的片段的测序引物以及每个样品的index测序引物，而且，同时还需要对混入的λ-DNA文库(PhiX文库)的相应测序引物进行变更才可进行测序。

因此，仍需要对现有的建库方法进行改进，以便提供一种快捷、污染较少的扩增子测序文库构建方法，而且后续上机测序步骤也比较方便。

发明内容

本发明旨在提供一种适用于扩增子测序文库构建的引物及扩增子测序文库的构建方法，以解决现有技术中扩增子测序文库构建方法中所存在的步骤繁琐或容易污染且后续上机测序也不方便的缺陷。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种适用于扩增子测序文库构建的引物，该引物仅由一对引物构成，且一对引物中的上游引物和下游引物按照从5’端至3’端的顺序均包括接头序列、测序引物序列和目的片段扩增引物序列。

进一步地，上游引物中的接头序列为P5端接头序列，下游引物中的接头序列为P7端接头序列，下游引物中的测序引物序列还包括标签序列，标签序列为6～10个碱基按不同的排列组合所形成的序列。

进一步地，引物用于构建16S rDNA v4区、18S rDNA、ITS或功能基因的扩增子测序文库。

进一步地，当引物用于构建16S rDNA v4区的扩增子测序文库时，引物包括：SEQ ID NO.1所示的上游引物；以及SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的任一条下游引物。

进一步地，当引物用于构建18S rDNA、ITS或功能基因的扩增子测序文库时，引物中的目的片段扩增引物序列为18S rDNA、ITS或功能基因上的保守序列。

根据本发明的另一方面，还提供了一种扩增子测序文库的构建方法，该构建方法通过利用上述任一对引物经一步扩增步骤得到扩增子测序文库。