[发明专利]一种3’-5’外切酶活性测定方法

说明书

技术领域

本发明属于生化技术领域，具体来说涉及一种3’-5’外切酶活性测定方法。 

背景技术

Pfu DNA聚合酶（简称Pfu）是一种来源于嗜热菌强烈炽热球菌（Pyrococcus furiosus）的高度热稳定的DNA聚合酶。Pfu具有两种活性：5’-3’聚合酶活性以及3’-5’外切酶活性（或称校对活性）。Pfu的3’-5’外切酶活性非常强，可以降解DNA合成链中碱基错配的核苷酸，大大增加了碱基配对的正确率，保证了DNA合成的高度忠实性。因此，该酶是目前耐热DNA聚合酶中保真度最高的酶，适合使用在那些需要高精确度的PCR应用中，包括克隆、基因表达和突变分析。 

Pfu的高3’-5’外切酶活性虽然可以带来高的保真度，但同时也会引起一些副作用。3’-5’外切酶活性会降解引物，特别是溶液中没有dNTP的情况下。所以，在配制PCR反应体系时，最好在冰上操作，且Pfu必须是最后加入到反应体系中，并立即进行PCR反应。另外，Pfu扩增产物为平端。如果需要进行TA克隆的话，需要首先将PCR产物纯化，去掉Pfu，再进行加A尾反应；否则，Pfu的3’-5’外切酶活性会将加上的A切掉，导致TA克隆失败。因此，业内一直希望找到一种可逆的封闭Pfu 3’-5’外切酶活性的方法，旨在不改变Pfu高保真度的前提下，减少甚至消除3’-5’外切酶活性带来的副作用，以提高Pfu相关应用的便利性。 

但是找到在找到相应的封闭活性方法之前，首先要解决的一个问题是如何建立3’-5’外切酶活性的方法。标准的测活方法采用放射性同位素法，即首先合成一条3’末端带³H标记dATP的单链寡核苷酸。3’-5’外切酶活性可将[³H]-dATP切除。再经过TCA沉淀、过滤，通过测定酸可溶性物质中放射性的含量，计算3’-5’外切酶活性。这种方法易产生放射性污染，且步骤多、周期长，难以实现高通量、自动化，因此为筛选带来了困难。 

发明内容

本发明建立了一种简便、快速、非放射性的3’-5’外切酶测活方法，利用该方法，可以快速大量的筛选目标产物，为寻找针对该3’-5’外切酶活性的封闭试剂提供了一种可靠简便的途径。 

具体来说，本发明采用的技术方案如下： 

一种3’-5’外切酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括：首先根据单链模板合成有3’错配的引物，将引物与单链模板混合并退火，接着在该反应液中加入3’-5’外切酶活性进行3’碱基外切反应，然后加入足量没有3’-5’外切酶活性的聚合酶延长引物直至获得双链DNA，随后检测反应体系中双链DNA的相对量，并根据检测结果推导出3’-5’外切酶活性程度。

其中，反应体系中双链DNA的相对量可以通过检测双链DNA的量或者单链DNA的量而得到。 

优选地，反应体系中单链DNA的存在量的检测是利用仅与双链DNA或仅与单链DNA结合的荧光染料，更优选采用双链DNA特异性荧光染料，在一个实施方案中，本发明方案中采用的是当前在本领域中已经成熟使用的商购picogreen染料。在此，双链DNA的相对量是以荧光强度表示的。 

本发明测定方法中所采用的单链模板可以选用任何适合的单链模板，优选采用环状单链DNA，这样在聚合反应结束后，可以得到闭合的环状双链体，处理技术成熟，并且环状双链体可以避免对后续测量的干扰。在一个优选实施方案中，所采用的单链模板是M13噬菌体单链DNA，简称M13。M13是在生化技术中广泛使用的一种单链DNA载体，因此可以此为基础建立一种标准的测量技术。 

所述测定方法中错配引物中3’错配的数目优选是1个。 

在一个优选实施方案中，所采用的引物序列是5’-aagccatccgcaaaaatgacctcta-3’，其中加下划线的碱基表示错配碱基。 

所加入的没有3’-5’外切酶活性的聚合酶可以采用任何适合的DNA聚合酶，在一个优选实施方案中，所采用的没有3’-5’外切酶活性的聚合酶是指Taq酶。 

在另一实施方案中，所要测定的3’-5’外切酶活性是指具有3’-5’外切酶活性的Pfu酶。 

本发明的优点： 

1.无放射性污染；

2.操作步骤简单快速，无需TCA沉淀、洗涤、干燥、洗脱步骤；可实现高通量、自动化的活性测定；

3.可以用来针对3’-5’外切酶活性进行阻断活性筛选。

附图说明