[发明专利]一种Poly (A)聚合酶活性测定方法

说明书

技术领域

本发明属于生化技术领域，具体来说涉及一种Poly (A)聚合酶活性测定方法。 

背景技术

Poly(A)聚合酶(Poly(A)polymerase，PAP)是一种特殊的RNA聚合酶。该酶可不依赖模板特异性的催化三磷酸腺甘(ATP)，逐个聚合至单链RNA片段的3’-OH端上，其反应方程式为： 

PAP是基因工程技术，特别是microRNA研究中一种重要的工具酶。microRNA是一种长度在21nt左右的单链RNA，没有成熟的mRNA中常见的poly A尾巴。PAP可以在microRNA的3’-OH末端加上长度不一的poly A尾巴，这样就可以universal-oligo dT为引物与加上的poly A尾巴结合进行逆转录；再用特异的正向引物与universal反向引物进行PCR，从而实现microRNA的检测，其原理如图1所示。 

PAP加尾反应是上述流程的第一步，也是最关键的步骤。因此，准确测定PAP酶的活性，保证批次活性的稳定性，对于microRNA检测试剂盒的性能和质量具有至关重要的意义。 

标准的PAP酶活力测定法采用放射性底物掺入法，即采用以3H标记的ATP为底物，经PAP催化使其掺入到oligo(rA)₁₅上，其反应式如下： 

通过测定酸不溶性产物中放射性同位素的量，计算出PAP酶的活性。这种方法关键在于掺入产物和标记ATP的分离。三氯乙酸TCA可使oligo(rA)15沉淀，而标记的ATP不被沉淀；将TCA处理的产物加在whatman滤纸上，就可以实现掺入产物和标记ATP的分离。再经过洗涤、干燥、洗脱，最后测定放射性同位素或者荧光强度。因此，“掺入法”存在易产生放射性污染、步骤多、周期长的 缺陷，难以实现高通量、自动化。 

发明内容

本发明的目的是建立一种简便、快速、非放射性的PAP酶测活方法。本发明摈弃了传统的“掺入法”，采用了一种全新的“转化法”，其原理如图2所示。 

具体来说，本发明采用了以下技术方案： 

一种Poly (A)聚合酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括：首先根据单链模板合成引物，然后进行PAP酶催化的加尾反应，反应完成后与单链模板退火，随后在足量没有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶存在下进行聚合反应生成双链DNA，最后测定聚合反应完成后反应体系中双链DNA的相对量，并由该检测结果推导出Poly (A)聚合酶活性程度，其中所用单链模板上引物3’方向上第一位的碱基不是t。

优选地，反应体系中双链DNA的相对量是利用荧光染料，例如仅与双链DNA或仅与单链DNA结合的荧光染料，利用荧光法检测得到的，并且双链DNA的相对量是以荧光强度表示的。 

在一个实施方案中，所采用的荧光染料是双链DNA特异性荧光染料。更优选，所采用的荧光染料是picogreen染料。 

优选地，所采用的单链模板是单链环状DNA模板。更优选，所采用的单链模板是M13噬菌体单链DNA。因此，在一个实施方案中，所用的引物是5’-aagccatccgcaaaaatgacctct-3’。并且据此可以建立一套标准的测定方法。 

在一个实施方案中，所采用的DNA聚合酶是Klenow DNA聚合酶exo-突变体，即突变致使3’-5’外切酶活性缺失的Klenow大片段。 

本发明的优点： 

1. 无放射性污染；

2. 操作步骤简单快速，无需TCA沉淀、洗涤、干燥、洗脱步骤；可实现高通量、自动化的活性测定。

3. 灵敏度高，可检测到0.1 U的PAP活性。 

附图说明

图1是采用PAP测定microRNA的原理图。 

图2是本发明的Poly (A)聚合酶活性测定方法的原理图。 

图3是本发明方法的一个实施例中PAP活性与荧光强度的关系图。 

图4是本发明方法的另一个实施例中PAP活性与荧光强度的关系图。 

具体实施方式