[发明专利]一种新的RAPD方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种RAPD方法。

背景技术

RAPD(random amplified polymorphic DNA)技术，即随机扩增多态性DNA技术，是建立在PCR(Polymerase Chain Reaction)基础之上的一种运用随机引物扩增，寻找DNA片段遗传标记的分子生物学技术，现已广泛应用于生物的遗传图谱构建、品种优选与分子鉴定、亲源关系分析、系统分类和发育进化关系的研究上。

RAPD技术是在PCR方法的基础上建立起来的，先以基因组DNA为模板，以单个人工合成的随机多态核苷酸序列为引物进行PCR扩增后，将扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、溴化乙锭染色，在紫外透视仪上检测多态性。

RAPD技术中，目前常用的PCR扩增方法与传统PCR相比，仅有两个区别：1、采用单链随机引物，长度通常为10个碱基；2、因采用的是随机引物，因此退火温度较低，其余条件基本相同。然而，采用目前的方法难以得到多态性丰富、条带数增多、强弱带分明的RAPD图谱。

需要提供一种新的RAPD方法。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种新的RAPD方法。

本发明RAPD方法，包括如下步骤：

(1)PCR扩增：采用GC含量为90～100％的引物进行PCR扩增，扩增时，退火到延伸的升温速率为0.125～1℃/s；

(2)检测：对扩增结果进行检测。

步骤(1)中，所述PCR扩增的引物长度为10个碱基。优选地，所述PCR扩增的引物如SEQ ID NO：1～22所示。

步骤(1)中，所述升温速率为0.125℃/s。

步骤(1)中，所述PCR扩增的反应程序为：

1        95℃预变性        90s

2        94℃变性          40s

3        30～42℃退火      60s

4        72℃延伸          90s

         40个循环

5        72℃              5min

6        4℃保温。

40个循环：指重复2、3、4步骤39次。

其中，所述退火温度优选为36℃。

步骤(1)中，所述PCR扩增的体系为：总体积为10μl时，

模板(10ng/μl)          1μl

引物(2.5μM)            1μl

2×MasterMix            5μl

ddH₂O                   3μl；

MasterMix：包含除模板、引物以外的各种PCR反应所需的成分。

所述2×MasterMix可以是型号为KT207-01的2×PCR MasterMix，也可以是其它型号的2×PCR MasterMix。

步骤(2)中，所述检测采用的方法为凝胶电泳。

根据本领域常识，PCR扩增时，引物的GC含量最好在40％～60％之间，最高不超过70％，如果GC含量过高，将导致难以扩增。

然而，本发明RAPD方法中，PCR扩增采用GC含量高达90～100％的引物，在特定条件下(退火到延伸的升温速率为0.125～1℃/s)，可以扩增得到产物，而且，与常规PCR(引物GC含量为60～70％，退火到延伸的升温速率为2.5℃/s)相比，扩增的条带数量更多，多态性更好，取得了意料不到的技术效果。

本发明RAPD方法，通过改进PCR扩增的引物以及退火到延伸的升温速率，提高了PCR扩增的效率和产量，产生了多态性丰富、条带数增多、强弱带分明的RAPD指纹图谱，具有良好的应用前景。

下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、组合、替换或变更。

附图说明