[发明专利]一种飞秒激光双光子荧光生物显微成像系统及其成像方法

说明书

技术领域

本发明涉及飞秒激光双光子荧光生物显微成像系统及其成像方法。

背景技术

荧光是某些物质受一定波长的光激发后在极短时间内发射出波长大于激发波长的一种发光现象。十九世纪中期，英国科学家G.Stokes利用紫外光照射萤石矿物第一次观察到了荧光现象，但是直到二十世纪三十年代，奥地利科学家M.Haitinger等人才将荧光标记技术引入到生命科学领域，他们使用荧光染料对细菌病毒等特定成分进行标记，推动了荧光显微镜的发展。

荧光显微镜的基本工作原理就是利用光照射有荧光物质标记的样品，产生的荧光信号通过滤波片与激励信号分开后被探测器采集，染料标记区域就会被分辨出来。由于普通荧光显微镜使用的汞灯光源发射的主要是短波长的紫外光，使得成像的分辨率大大提高。但是当我们观察较厚样品时，样品的不同层次深度上均有被标记的结构，而且相互堆叠起来，普通荧光显微镜的光源会同时激发样品在焦点附近的较大一片区域，导致焦点上下的散射光也会被收集，降低了分辨率。除此之外，荧光显微镜受到衍射极限的限制，其分辨率很难达到1μm以下。

20世纪80年代后期，作为目前世界上非常先进的生物学荧光成像技术，共聚焦荧光显微成像技术在生物材料的荧光显微成像领域得到了广泛应用。相比于传统的荧光显微镜，它的技术有以下改进：首先，采用方向性和单色性良好的激光作为光源消除了色差的影响；其次，共聚焦技术中小孔的存在挡住了焦点以外的杂散光，提高了信噪比；最后，逐点逐行扫描只会激发焦平面内极小区域的荧光，避免了标本上相邻点的衍射光和散射光的干扰，大大提高了图像的清晰度和精密度。

共聚焦荧光显微成像技术如图1所示，装置包括激光光源(1)、样品(2)、探测器(3)、物镜(4)、焦点(5)、二向色镜(6)和共焦小孔(7)，以光学系统的共焦成像为基础，激光光源(1)、样品(2)和探测器(3)处于彼此共轭的位置。光源经物镜(4)在样品(2)内聚焦成衍射极限的光点，样品发射的荧光被物镜(4)汇聚到达共焦小孔(7)内，被靠近共焦小孔(7)的探测器(3)接收。激光通过对样品进行的扫描而对物体进行成像。然而共焦小孔(5)不仅挡住了焦点(5)以外产生的荧光，还挡住了焦点(5)产生的被生物组织散射的荧光，导致荧光的收集效率下降。

双光子荧光显微成像技术如图2所示，装置包括激光光源(1)、样品(2)、探测器(3)、物镜(4)、焦点(5)和二向色镜(6)，与共聚焦荧光显微成像技术不同的是，双光子荧光显微成像技术利用近红外的飞秒激光作为光源而非利用紫外光源。而且双光子吸收的非线性本质使得双光子荧光显微成像技术无需共焦小孔的加入，与传统的单光子激光共聚焦显微镜相比，双光子荧光显微成像技术具有以下几个优点：①荧光收集率高：双光子显微成像无需共焦小孔的加入，因此荧光收集效率大大提高；②光损伤小：双光子荧光显微镜的激励源使用可见光或者近红外光，它们对生物活体组织的光损伤小，因此可以对样品进行长时间的科学研究；③空间分辨率和对比度高：由于在双光子显微成像中，荧光只有在焦平面很小的区域内产生，焦点外无荧光产生，背景荧光影响小；④光漂白区很小：焦点外不发生漂白现象。⑤成像深度大：可见光或近红外光比紫外光的穿透性强，一般情况下，共聚焦荧光显微成像技术的成像深度只能达到50μm左右，而双光子显微成像技术的成像深度可达1600μm；⑥对探测光路的要求低：对于双光子显微成像而言，发射荧光的波长值与激发光相差很大，因此对探测收集系统的要求比单光子共焦显微镜低；⑦适合多标记复合成像：由于很多染料荧光探针的双光子激发光谱比较宽，多种探针可以同时被单一波长的激发光激发，进而得到同一样品的不同信息。

虽然商业化的双光子荧光显微镜已经问世，但是其成本昂贵、成像速度无法满足需求。外界环境的影响很容易导致飞秒激光器失锁，而激光器失锁后无法激励样品产生双光子荧光信号。双光子荧光显微成像是对样品特定成分进行成像，不能对样品进行完整成像。

发明内容

本发明的目的是为了解决目前双光子荧光显微镜成本昂贵、成像速度无法满足需求。外界环境的影响容易导致飞秒激光器失锁，而激光器失锁后无法激励样品产生双光子荧光信号。双光子荧光显微成像是对样品特定成分进行成像，不能对样品进行完整成像。而提出了一种飞秒激光双光子荧光生物显微成像系统及其成像方法。

上述的发明目的是通过以下技术方案实现的：