[发明专利]一种鱼类精巢组织总RNA的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及鱼类总RNA的提取，具体地说，涉及一种鱼类精巢组织总RNA的提取方法。

背景技术

总RNA分离纯化技术是分子生物学研究技术的基础，从组织中提取纯度稳定、完整性好、重复性高、无污染的总RNA的分离纯化方法，是决定后续实验结果质量的关键，一些特定的部位使用通用的RNA分离纯化方法，往往不能满足要求，需要相应的处理与提取制备方法。

鱼类精巢组织内含有大量的蛋白成分(精原细胞、精母细胞和精子等)和结缔组织，采用常规RNA分离纯化方法，在抽提的过程中容易蛋白污染，而且操作过程中样本不易研磨，裂解时易产生粘稠胶团，造成抽提过程中RNA的降解和得率偏低。由于存在上述问题，使鱼类精巢组织总RNA难以稳定的分离和纯化。

目前，有针对性的分离纯化鱼精巢组织总RNA的方法较少，用传统方法处理鱼精巢组织研磨不充分、裂解易形成粘稠胶团、提取的总RNA浓度低、稳定性差、污染率高，无法满足后续实验的要求。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种适用于鱼类精巢组织总RNA的提取方法。

为了实现本发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种鱼类精巢组织总RNA的提取方法，具体为：将鱼类精巢组织经液氮速冻，Trizol裂解液处理后匀浆、过滤、离心，经蛋白酶K消化、氯仿-正丁醇混合液萃取后，再经异丙醇-醋酸钠沉淀，DNA酶处理后，经洗涤而获得鱼类精巢组织总RNA。

进一步地，所述Trizol裂解液使用前加入β-巯基乙醇和/或8-羟基喹啉，使其在所述Trizol裂解液中的体积浓度分别为1.0-2.5％和0.10-0.15％。由于Trizol裂解液本身含有0.10％的8-羟基喹啉，因此也可不再加入8-羟基喹啉。但为了更好的抑制内源RNA酶活性，减少RNA的降解，还可有效的排除核蛋白、色素等物质的干扰，在Trizol裂解液使用前加入0.05％8-羟基喹啉，使其在Trizol裂解液中的体积浓度达到0.15％。

进一步地，所述过滤使用35-40目滤网过滤。

作为优选，所述氯仿-正丁醇混合液使用量为1/4Trizol体积。

进一步地，所述氯仿-正丁醇混合液中氯仿与正丁醇的体积比为24:1。

进一步地，在使用异丙醇-醋酸钠沉淀RNA前，加入RNase-free的脂质体。

进一步地，在经异丙醇-醋酸钠沉淀时，异丙醇与醋酸钠的体积比为4:1。

进一步地，所述提取方法具体包括以下步骤：

1)取鱼类精巢组织，无菌RNase-free水清洗后放入液氮中速冻，超低温冻存；

2)将冻存样本转入含有Trizol裂解液的RNase-free EP管中，匀浆后置于冰中，超声破碎，过滤，离心，取上清；

3)加入RNase-free水稀释，再加入蛋白酶K，振荡摇匀，离心，取上清；

4)加入氯仿和正丁醇混合液，振荡摇匀至均匀的乳白状絮状，室温静置，离心，取上清；

5)加入RNase-free的脂质体；

6)加入与步骤5)混合液等体积的异丙醇-醋酸钠混合液，振荡摇匀，离心，弃上清液；

7)用预冷的乙醇悬浮沉淀，离心，弃去乙醇，晾干，加入RNase-free水充分溶解；

8)加入RNase-free DNase缓冲液、RNase-free DNA酶、RNA酶抑制剂和RNase-free水，处理40-50min，得到DNA酶处理液；

9)加入乙二胺四乙酸，加热处理灭酶活，随后依次加入RNase-free水、醋酸钠和预冷的无水乙醇，混匀后放置15-25min，离心，弃上清；

10)用预冷的乙醇洗涤沉淀，离心，弃上清，室温封闭静置5-10min，晾干，加入RNase-free水或0.5％的SDS溶液充分溶解，-80℃保存。

更进一步地，所述提取方法具体包括以下步骤：

1)取60-80mg鱼类精巢组织，无菌RNase-free水清洗后迅速放入液氮中速冻，-80℃超低温冻存；

2)将冻存样本迅速转入含有1ml Trizol裂解液的RNase-free EP管中，使用RNase-free电动匀浆器匀浆，将EP管放置于冰中，超声破碎8-10s，间隔15-20s，超声破碎8-10s，使用35-40目过滤网过滤一次，17000-19000g 4℃离心5min，取上清；