[发明专利]用于基于血液样品构建测序文库的方法及其在确定胎儿遗传异常中的用途

权利要求书

1.一种基于血液样品构建测序文库的方法，其特征在于，包括：

从所述血液样品分离DNA样品；

对所述DNA样品进行去磷酸化处理以便获得经过去磷酸化的DNA；

对所述经过去磷酸化的DNA进行末端修复，以便获得双链DNA片段，其中，所述双链DNA片段具有两个平端末端，并且四个末端核苷酸均缺少磷酸基团；

将相互不同的第一和第二接头与所述双链DNA片段相连，以便获得第一连接产物，其中第一和第二接头的每一个均是分离的寡核苷酸，所述分离的寡核苷酸包括：第一链，所述第一链的5’末端核苷酸具有磷酸基团，并且所述第一链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸；以及第二链，所述第二链的5’末端核苷酸不具有磷酸基团，并且所述第二链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸，其中，所述第一链的长度大于所述第二链的长度，并且所述第一链和所述第二链之间形成双链结构；

利用第一单链DNA置换所述第一接头的第二链，利用第二单链DNA置换所述第二接头的第二链，以便获得第二连接产物，其中，第一单链DNA适于与第一接头的第一链形成双链结构，所述第二单链DNA适于与第二接头的第一链形成双链结构；

利用第一引物和第二引物对所述第二连接产物进行扩增，其中，所述第一引物包括与所述第一单链DNA和第二单链DNA之一相同的序列，所述第二引物包括与所述第一单链DNA和第二单链DNA的另一个相同的序列，并且所述第一引物和第二引物之一具有额外的生物素标记，所述扩增产物是在两个末端分别具有一个接头的DNA片段；

从所述在两个末端分别具有一个接头的DNA片段分离单链DNA片段；以及

将所述单链DNA片段进行环化处理，以便获得单链环状DNA，所述单链环状DNA构成所述测序文库；

其中，从所述两个末端分别连接具有一个接头的DNA片段分离单链DNA片段进一步包括：

使所述两个末端分别具有一个接头的DNA片段与磁珠接触，以便形成磁珠-DNA复合物，其中，所述磁珠上连接有链霉亲和素；

将所述磁珠-DNA复合物与pH高于7的溶液接触，以便获得所述单链DNA片段。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血液样品为血浆。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA样品为游离核酸样品。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA样品为从有核红细胞分离的基因组DNA，并且在对所述DNA样品进行所述去磷酸化处理之前，预先将所述基因组DNA进行打断，以便获得长度为100～200bp的DNA片段。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一接头和所述第二接头的每一个分别独立地包括：

第一突出端，所述第一突出端位于所述第一链的3’端；以及

任选的第二突出端，所述第二突出端位于所述第二链的5’端。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一突出端的长度大于所述第二突出端的长度。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一突出端的长度为6～12nt。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第二突出端的长度为0～4nt。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一链的长度为20～25nt。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二链的长度为10～15nt。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述双链DNA片段与第一接头和第二接头进行连接的步骤是在一步反应中完成的。