[发明专利]一种基因编码的过氧化氢荧光探针及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种基因编码的过氧化氢荧光探针和制备方法及其应用，包括对H₂O₂敏感的多肽OxyR和对H₂O₂进行表现的荧光蛋白cpYFP，将荧光蛋白cpYFP插入到对H₂O₂敏感的多肽OxyR中，形成荧光探针，其特征在于：所述过氧化氢荧光探针为对荧光探针中的荧光蛋白cpYFP序列进行突变而得到的突变体。该基因编码的H₂O₂荧光探针可以在活菌、亚细胞水平检测H₂O₂；探针特异性非常好，对H₂O₂具有选择性，且对H₂O₂的动态响应变化没有因为突变位点的引入而受影响。

技术领域

本发明属于生物化学、蛋白质化学及分子生物学领域，具体地涉及能够提高过氧化氢探针HyPer荧光强度的突变蛋白及基因编码核苷酸序列，还涉及该突变体蛋白及其核苷酸序列的制备方法及其在检测H₂O₂中的应用。

背景技术

活性氧(ROS)是由分子氧衍生的一系列活性分子(例如H₂O₂)、游离自由基的总称。在氧化还原代谢过程中，ROS是不同生理和病理过程的关键介质。游离的氧分子对需氧生物来说是有害的。这些分子主要是线粒体呼吸作用过程中发生电子转移产生的副产物，以及氧化还原酶、金属催化氧化过程中产生的副产物。之前的报道称只有吞噬细胞才会与ROS的产生有关，因为这种细胞含有对抗宿主细胞的防御机制。但是最近的研究已经证明，ROS对细胞信号，包括细胞凋亡、基因表达和细胞信号级联反应的激活，都起到了重要的作用。ROS还是细胞内部和细胞之间的信使。

作为活性氧(ROS)的主要家族成员之一，H₂O₂被广泛用于化学、生物、药学、临床、环境和食品等领域。H₂O₂与各种中枢神经系统的疾病相关，如阿尔茨海默氏症，帕金森氏病和肌萎缩性侧索硬化。此外H₂O₂也是酸雨形成的因素之一。因此无论在环境、临床还是药学领域，对H₂O₂进行精确检测都是非常重要的。

目前已经报道了各种检测胞内H₂O₂的方法，如滴定分析，分光光度分析法，荧光分析法，电解分析等，其中荧光分析法是一种有前景的检测方法，能够快速、高选择、实时地监测H₂O₂。目前有以下几种探针用于检测H₂O₂：

1、H₂O₂在辣根过氧化酶(HRP)的催化作用下，能够与Amplex Red进行1:1的反应，产生高荧光产物试卤灵。HRP对H₂O₂具有选择性，而Amplex Red对二者的底物具有高度的灵敏性和稳定性，产物试卤灵也是很稳定的，它的长波段会避免大多数生物体自发荧光造成的干扰。鉴于AmplexRed的高灵敏性、特异性和化学稳定性，它被广泛用于不同生物体中H₂O₂的低水平测量，然而这个反应产物试卤灵是剧毒产品，且必须避光保存，使检测方法局限性较大。

2、基于snap-tag的去保护荧光探针和基于细胞器标记的体内成像方法。这些方法可以选择性的检测H₂O₂，但是不适合检测H₂O₂浓度的动态变化。