[发明专利]极小单胞菌T2及其在微生物降解尼古丁中的应用

权利要求书

1.极小单胞菌(Pusillimonas sp.)T2，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏日期为2014年6月23日，保藏编号为CCTCC No:M 2014272。

2.如权利要求1所述极小单胞菌T2在微生物降解尼古丁中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：将极小单胞菌T2经发酵培养获得的含菌发酵液离心，沉淀用pH值为7.0的磷酸缓冲液悬浮制成菌悬液作为酶源，以尼古丁为底物，于无机盐培养基中，在25～45℃、pH值5.5～8.5、100～200rpm、黑暗条件下进行降解反应，反应完全后，实现对尼古丁的降解。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述尼古丁终浓度为100～1500mg/L培养基，所述酶源用量以含菌细胞数计为1×10⁶～5×10⁶个/mL培养基。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述每升无机盐培养基中含有NaCl 1g，K₂HPO₄1.5g，KH₂PO₄0.5g，(NH₄)₂SO₄1.5g，MgSO₄0.1g，1ml微量元素溶液，溶剂为超纯水，自然pH值；每升微量元素溶液中含MnSO₄·H₂O 0.13_g，ZnCl₂ 0.23g，CuSO₄·H₂O 0.03g，CoCl₂·6H₂O 0.42g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.15g，AlCl₃·6H₂O 0.05g，溶剂为超纯水。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述酶源按如下步骤制备：

(1)斜面培养：将极小单胞菌T2接种于斜面培养基，20～40℃培养3～5天，获得菌体斜面；所述斜面培养基的终浓度组成为：酵母粉10.0g/L，蛋白胨5.0g/L，氯化钠10.0g/L，琼脂20.0g/L，溶剂为超纯水，pH值自然；

(2)种子培养：从步骤(1)菌体斜面上挑取一接种环菌体接种至无机盐培养基中，25～40℃培养3～5天，获得种子液；所述每升无机盐培养基组成为：NaCl 1g，K₂HPO₄1.5g，KH₂PO₄0.5g，(NH₄)₂SO₄1.5g，MgSO₄0.1g，1ml微量元素溶液，溶剂为超纯水，自然pH值；每升微量元素溶液组成为：MnSO₄·H₂O 0.13_g，ZnCl₂ 0.23g，CuSO₄·H₂O 0.03g，CoCl₂·6H₂O 0.42g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.15g，AlCl₃·6H₂O 0.05g，溶剂为超纯水；

(3)发酵培养：将步骤(2)获得的种子液以体积浓度10～20％的接种量接种至LB液体培养基中，30℃、150rpm振荡培养至OD600为0.1～0.15，获得发酵液，将发酵液离心，弃上清液，沉淀用pH值为7.0的磷酸缓冲液悬浮制成菌悬液，即为酶源；所述每升LB液体培养基组成为：酵母粉10.0g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，溶剂为超纯水，自然pH值。