[发明专利]一种以微卫星为分子标记筛选酿酒酵母乙酸耐受性性状的方法

说明书

技术领域

本发明涉及酿酒酵母乙酸耐受性的筛选，特别是以微卫星ScAAT3为分子标记的筛选，属于遗传领域。

背景技术

酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是一类重要的工业微生物，被广泛应用于食品焙烤、啤酒、酒精、白酒、黄酒、葡萄酒、清酒的酿造和有机酸的生产等方面。酿酒酵母在进行有机酸发酵时，发酵醪液pH往往低于3.5，有时甚至达到2.5，这不利于生产菌株的生长及产物的生成，提高了生产成本。研究发现，酿酒酵母的耐有机酸能力与菌株来源、酸性物质种类和培养方式等均密切相关。因此筛选耐酸能力强的酿酒酵母生产菌株有利于提高生产效率，降低生产成本，在工业生产中有着巨大的商业价值。

传统的酿酒酵母遗传性状的筛选方法主要有基因敲除法和大批量诱变筛选法。在基因敲除后酵母的表型性状会发生改变，因此可通过基因敲除来对酵母遗传性状进行筛选。但由于表型性状是由基因型与多种因素共同作用的结果，因此通过基因敲除来对酵母遗传性状进行筛选准确性较低。而通过诱变的方法对酿酒酵母遗传性状进行筛选，效率较低，且需要耗费大量的人力、物力和财力。目前，遗传标记已成为分子生态学研究的重要手段，被广泛用于揭示酿酒酵母遗传多样性。DNA标记能直接反应基因组DNA间的差异，如：单核苷酸多态性标记(SNP)，随机扩增多态性标记(RAPD)，限制性片段长度多态性标记(RFLP)和扩增片段长度多态性标记(AFLP)等。SNP是检测等位序列上的单个核苷酸存在的差异，因此SNP是二等位多态性，RPAD标记扩增出来的DNA片段具有随机性和任意性，但一般表现为显性遗传，不能区分显性纯合和杂合的基因型；RFLP标记需要消耗大量时间且需要使用放射性标记，效率较低切操作程序复杂。AFLP标记通过选择性扩增基因组DNA酶切片段所产生的扩增产物的多态性，该技术结合了RFLP的稳定性和PCR的技术，同时克服例如RELP带型少，信息量小及RAPD技术不稳定的缺点。但同时也更加费时费力，程序复杂，因此有必要开发一种新的简单快速，可靠的筛选方法。

微卫星DNA序列(SSR)，是一类由几个(多为1-6个)碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列，在众多的遗传标记技术中，它具有不受环境影响，多态性高，特异性强，遗传稳定，与生物表型相关度高，并能直接反映DNA序列水平的遗传变异等特点。近年来，微卫星DNA分子标记作为新兴的标记技术，以其多态点丰富、与生物表型相关度高等优点在生物遗传多样性、等位基因鉴定等研究方面已经取得了较好的结果，也广泛用于酿酒酵母菌株的分类鉴定、菌株间的亲缘关系分析和酿酒酵母群体遗传多样性分析。

本研究首次将SSR分子标记与酿酒酵母乙酸耐受性性状相结合,探索SSR分子与酿酒酵母乙酸耐受性性状相关性，为利用SSR对酿酒酵母乙酸耐受性性状筛选提供一种较为有效的方法，并为以SSR为分子标记对微生物遗传性状进行筛选提供借鉴。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种以微卫星位点为分子标记对酿酒酵母乙酸耐受性性状进行筛选的方法。

所述微卫星位点为ScAAT3，该微卫星位点与酿酒酵母乙酸耐受性成正相关(p<0.05)，可以作为酿酒酵母乙酸耐受性性状筛选的分子标记。

本发明要解决的另一个技术问题是以微卫星为分子标记，建立酿酒酵母乙酸耐受性与11个微卫星相关性。

选取酿酒酵母基因组中11个微卫星位点，通过PCR扩增技术对44株酿酒酵母生产菌株进行准确快速分型，并建立相关的基因型数据库。根据实验菌株的耐酸表型差异，利用SPSS软件统计分析，建立酿酒酵母微卫星与乙酸耐受性性状之间的相关性。

与传统方法相比，本发明提供的以微卫星ScAAT3为分子标记对酿酒酵母乙酸耐受性进行筛选的方法，具有丰度高、多态性高、共显性标记、可以鉴别出杂合子和纯合子，实验重复性好，结果可靠，选择中性、可自动化检测分析等特点，具有广阔的应用价值。

附图说明

图144株菌乙酸耐受性表型鉴定结果

图2酿酒酵母在ScAAT3和AT-X位点处的等位基因多态性

具体实施方式

YPD培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖10g/L

醋酸母液：配置5mM的醋酸溶液，用NaOH调节其pH至4.5，现配现用。

YPD醋酸平板：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖10g/L、琼脂粉2g，pH4.5，灭菌后分别添加终浓度为50、70、90和110mM的醋酸母液。