[发明专利]一种甲氧苄啶半抗原T2制备完全抗原的方法及应用有效
申请号: | 201410510573.9 | 申请日: | 2014-09-29 |
公开(公告)号: | CN104341357A | 公开(公告)日: | 2015-02-11 |
发明(设计)人: | 匡华;徐乃丰;胥传来;徐丽广;马伟;刘丽强;宋珊珊;吴晓玲 | 申请(专利权)人: | 江南大学 |
主分类号: | C07D239/49 | 分类号: | C07D239/49;C07K14/765;C07K14/77;C07K14/795;C07K1/107;C07K16/44;G01N33/531 |
代理公司: | 无锡市大为专利商标事务所(普通合伙) 32104 | 代理人: | 时旭丹;刘品超 |
地址: | 214122 江苏省无锡市*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 甲氧苄啶 半抗原 t2 制备 完全 抗原 方法 应用 | ||
1.一种甲氧苄啶半抗原T2的制备方法,其特征在于:
甲氧苄啶半抗原T2结构简式为:
;
步骤为:100mL三颈瓶中依次加入10mL吡啶、3.2 g对氨基苯甲酸、5mg 4-二甲氨基吡啶,60℃水浴加热磁力搅拌至溶液澄清;另以10mL 吡啶溶解2.9 g甲氧苄啶并滴加到所述三颈瓶中,继续搅拌反应3天;采用薄层色谱法,以甲醇︰四氢呋喃︰三氯甲烷体积比为1︰1︰5作为展开剂监控反应进程;减压0.092 MPa、60℃蒸馏10min将溶剂全部蒸走,得到黄色油状物;继续滴加质量体积比为10%的NaHCO3水溶液至不再产生浑浊,过滤并调节上清液在pH5.0酸性条件下重结晶析出白色固体, 7500 r/min离心8min,滤饼60℃烘干即为甲氧苄啶半抗原T2。
2.用权利要求1所述方法制得的甲氧苄啶半抗原T2制备甲氧苄啶完全抗原的方法,其特征在于:将甲氧苄啶半抗原T2与载体蛋白偶联后制备得到甲氧苄啶完全抗原。
3.根据权利要求2所述用甲氧苄啶半抗原T2制备甲氧苄啶完全抗原的方法,其特征在于:所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、鸡卵清白蛋白OVA、匙孔血蓝蛋白KLH、血蓝蛋白LPH或人血清白蛋白HAS中的一种。
4.根据权利要求3所述用甲氧苄啶半抗原T2制备甲氧苄啶完全抗原的方法,其特征在于:制备50︰1及100︰1两种甲氧苄啶完全抗原T2-ZD-BSA,步骤为:
(1)甲氧苄啶半抗原T2的活化:将甲氧苄啶半抗原T2用DMF溶解,按甲氧苄啶半抗原T2︰盐酸摩尔比1︰2.5混合,盐酸溶液的浓度为1N,在4℃下预冷30min后,逐滴添加新配制的质量体积比为10% 的亚硝酸钠溶液,以淀粉-碘化钾试纸检测呈蓝黑色,继续搅拌反应2h,得到活化的甲氧苄啶半抗原T2溶液;
(2)载体蛋白BSA溶液的配制:取BSA,按甲氧苄啶半抗原T2︰BSA摩尔比分别为50︰1及100︰1,用0.1M pH9.6的碳酸盐缓冲液溶解,其中溶解后的BSA浓度大于3mg/mL,且碳酸盐缓冲液与DMF的体积比例为5︰1,得到BSA溶液;
(3)完全抗原的制备:将步骤(1)所得14.5mg/mL活化的甲氧苄啶半抗原T2溶液1mL慢速滴加到步骤(2)所得22mg/mL BSA溶液1.5mL及3mL中,室温下反应12h;用PBS缓冲液透析3天,期间换水8次,即得到50︰1及100︰1的两种甲氧苄啶完全抗原T2-ZD-BSA。
5.根据权利要求3所述用甲氧苄啶半抗原T2制备甲氧苄啶完全抗原的方法,其特征在于:制备免疫原T2-GA-BSA及包被原T2-GA-OVA的步骤为:
(1)甲氧苄啶半抗原T2的活化:将甲氧苄啶半抗原T2用DMF溶解,按甲氧苄啶半抗原T2︰戊二醛反应摩尔比为1︰1.5,在4℃下,搅拌反应2h,再在室温25℃下反应12h,得到活化的甲氧苄啶半抗原T2溶液;
(2)载体蛋白溶液的配置:取BSA及OVA,甲氧苄啶半抗原T2︰BSA/OVA的摩尔比均为100︰1,用0.1M pH9.6的碳酸盐缓冲液溶解,其中溶解后的蛋白浓度大于3mg/mL,且碳酸盐缓冲液与DMF的体积比例为5︰1,得到载体蛋白BSA/OVA溶液;
(3)甲氧苄啶完全抗原的制备:将步骤(1)制备的14.5mg/mL活化的甲氧苄啶半抗原T2溶液1mL,慢速滴加到步骤(2)制备的22mg/mL蛋白BSA溶液3mL及OVA溶液3mL中,室温下反应24h,用PBS缓冲液透析3天,期间换水8次,即得到甲氧苄啶免疫原T2-GA-BSA及包被原T2-GA-OVA。
6.用权利要求2、3、4或5所述方法制备的甲氧苄啶完全抗原的应用,其特征在于:通过甲氧苄啶完全抗原免疫得到多克隆抗体和/或单克隆抗体,用于检测甲氧苄啶。
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