[发明专利]一种β-葡萄糖苷酶及其制备方法与应用

说明书

本发明属于基因工程技术及生物医药领域，具体涉及一种β‑葡萄糖苷酶及其制备方法与应用，尤其是应用于酶法转化制备人参皂苷20(S)‑Rg3的应用。本发明所述β‑葡萄糖苷酶能耐受高温，在70℃下保温3h酶活力几乎不变；本发明所述β‑葡萄糖苷酶对人参皂苷Rb1的转化能力强，本发明所述β‑葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb1孵育60min，人参皂苷Rb1几乎完全转化为人参皂苷20(S)‑Rg3；本发明所述制备人参皂苷20(S)‑Rg3的方法酶促转化反应中间产物少，转化后产物人参皂苷20(S)‑Rg3纯度高。

技术领域

本发明属于基因工程技术及生物医药领域，具体涉及一种β-葡萄糖苷酶及其制备方法与应用，尤其是应用于酶法转化制备人参皂苷20(S)-Rg3的应用。

背景技术

人参(Panax ginseng C.A.Meyer)是一种多年生五茄科人参属药用植物，是我国传统名贵中药材，对治疗心血管疾病、糖尿病、精神类等疾病有较好的疗效。现代药物学研究已证明人参皂苷是其主要活性成分^[1]，其显著的抗肿瘤、抗炎、抗衰老活性一直以来都是研究的热点。

至今，已分离鉴定的人参皂苷有50余种，其中人参皂苷单体化合物Rg1、Rb1、Re、Rb2等含量较高，而人参皂苷Rd、Rg3、Rh2和Compound K等含量低，为稀有皂苷，但其药理活性优于上述高含量人参皂苷。其中，Rg3具有抗肿瘤、防治心脑血管疾病和冠心病、抑制癌细胞转移、保肝、保护神经、提高免疫力等多种药理活性。

然而Rg3不仅在天然人参中含量极其稀少，而且Rg3第20位的碳原子是手性碳，有两种旋光异构体：20(S)-Rg3和20(R)-Rg3。两者之间的理化及药理性质又具有较大的差异，特别是20(S)-Rg3的水溶性和生物利用度远远高于20(R)-Rg3，因此选择性的开发高效制备20(S)-Rg3的方法有重要的实际应用价值。

目前，制备20(S)-Rg3的方法主要包括化学方法、物理方法及生物转化法三种，其中有以20(S)-人参原三醇为原料通过化学合成制得20(S)-Rg3的报道，但是其反应步骤繁琐且得率很低，除此之外该方法所需原料本身也较难获得。而以人参中含量较高的Rb1，Rb2，Rc等人参皂苷通过热处理或酸处理等物理方法也能获得Rg3，但是所得产物为20(S)-Rg3和20(R)-Rg3的混合物，产品后期的分离耗时且成本较高。生物转化法主要有微生物转化法和酶法转化，微生物通过培养可以产生糖苷水解酶用于稀有人参皂苷的制备，但微生物产的酶种类复杂，各自专一性都有差异，使得微生物转化所得产物品质难以控制，对产品的纯度有一定影响。酶法转化能避免微生物转化法的缺陷，通过专一性的降解获得单一的转化产物。但是目前还没有用于生产人参皂苷20(S)-Rg3的糖苷水解酶被报道。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种β-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一些实施方案中，本发明所述的β-葡萄糖苷酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的另一个目的在于提供本发明所述的β-葡萄糖苷酶的制备方法，为获得本发明所述的β-葡萄糖苷酶的DNA分子，将该DNA分子插入表达载体获得重组质粒，将重组质粒转化表达宿主菌诱导表达，分离纯化即得。

在一些实施方案中，本发明所述的β-葡萄糖苷酶的制备方法，具体包括如下步骤：

1)、以提取的Thermotoga petrophila DSM 13995基因组DNA为模板，用具有SEQID NO:3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的下游引物扩增，PCR扩增得到权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶的DNA分子；

2)、将得到的本发明所述的β-葡萄糖苷酶的基因和pET-20b分别用Nde I和Xho I进行双酶切，连接得到含有本发明所述的β-葡萄糖苷酶的DNA分子的重组质粒；