[发明专利]一种荧光探针AH及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及荧光探针领域，具体涉及一种可用于选择性检测碱性磷酸酶的荧光探针。在细胞内常见的小分子5’磷酸核糖腺苷(简称AMP)上引入荧光团2’2羟苯基苯并噻唑(HBT)，与碱性磷酸酶作用后，利用反应物与产物的荧光差别实现选择性地检测活细胞中的碱性磷酸酶，并在斑马鱼的活体成像上取得良好的应用。

背景技术

碱性磷酸酶(ALP,ALKP,ALPase,Alk Phos)(EC 3.1.3.1)是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多，其次为肾脏，骨骼、肠、和胎盘等组织。ALP能介导蛋白质，核酸，及生物碱类等生物大分子的去磷酸化。该去磷酸化作用与激酶的磷酸化作用密切相关，是生物体内物质代谢、物质转运、信号转导等生命活动中必要的调节过程。目前公认的碱性磷酸酶偏高与肝脏疾病，肝肠循环，骨骼疾病密切相关。人血清的碱性磷酸酶广泛用于疾病的指示，当ALP产生过多或排泄受阻时，均可使血中ALP水平发生变化。但是其水平调控的内在机制并不清楚。因此，开发能够实时检测细胞中碱性磷酸酶的探针具有重要意义。

荧光探针是有效检测生命体内碱性磷酸酶的手段之一，相比吸光度法具有检测灵敏的优势。一个具有应用前景的荧光探针应具有作用前后荧光变化明显、对目标分子响应快、选择性好、合成简单等优点。目前应用于检测碱性磷酸酶的方法主要集中于血清碱性磷酸酶水平的检测，检测细胞中碱性磷酸酶的重要性并未受到太多重视。检测方法最广泛应用的还是405nm下检测pnpp(磷酸对硝基酚)的去磷酸化产物的吸收光谱，检测碱性磷酸酶的荧光探针虽然有一些新的发展，但是选择性好的荧光探针仍寥寥无几。尤其碱性磷酸酶，酸性磷酸酶，磷酸二酯酶，腺苷酸环化酶对于去磷酸化的作用有很多底物交叉现象，开发对其有选择性的探针具有很大挑战性。

发明内容

本发明就是针对上述问题，提供了一种可用于选择性检测细胞内碱性磷酸酶的荧光探针，此探针可以在生理条件下选择性地与碱性磷酸酶作用，作用后荧光显著增强。

本发明采用如下技术方案：采用2’2羟苯基苯并噻唑(HBT)作为荧光母体，在体内普遍存在的小分子5’磷酸核糖腺苷(简称AMP)上引入HBT，利用反应物与产物的荧光差别实现选择性地检测碱性磷酸酶，尤其是可以应用于检测活细胞中的碱性磷酸酶。合成的探针化合物的结构用代号AH表示。

所述荧光探针的结构式Ⅰ如下。

所述的荧光探针的制备方法为：以2’2羟苯基苯并噻唑(HBT)作为荧光母体，在体内普遍存在的小分子5’磷酸核糖腺苷(简称AMP)上引入HBT；具体制备步骤如下，

1)三氯氧磷与HBT于溶剂中搅拌反应后，真空下70℃加热蒸干；

2)步骤1)中得到的产物冷却后，加入溶剂，搅拌后，加入2’3’-O-isopropylideneadenosine，室温下搅拌反应10h后，真空下70℃加热蒸干，再加少量水，搅拌1h，与正丁醇共沸旋干；

3)步骤2)中得到的产物经硅胶柱层析纯化(用二氯甲烷和甲醇做洗脱剂)得化合物2’3’-O-isopropyadenosin 5’(HBT-phosphate)(白色固体)；

4)取步骤3)所得产物溶于醋酸和水中，冷凝回流，之后与正丁醇80℃下共沸旋干，甲醇洗涤产物三次，得到最终产物AH。

步骤1)中所述的HBT与三氯氧磷的加入量为1：3-10；步骤2)中2’3’-O-isopropylideneadenosine的加入量为第一步中HBT加入量的1.2-1.5倍；步骤3)中色谱法的rf为0.1，所述的二氯甲烷与甲醇的比例为10:1；步骤4)中加入的醋酸和水的量为4:1，冷凝回流的温度为100℃，时间为2h。

步骤1)和步骤2)中，所述的所用的溶剂为无水吡啶；步骤1)—4)中所述的搅拌方式为磁力搅拌。

所述的荧光探针可以用于碱性磷酸酶的定性或定量检测；所述的荧光探针和碱性磷酸酶的作用模型符合双位点酶动力学。

所述的荧光探针应用于检测碱性磷酸酶时，其是生成具有结构II的化合物，从而导致荧光变化，结构II的名称为2’2羟苯基苯并噻唑(HBT)。

所述的荧光探针在定量检测碱性磷酸酶中，与碱性磷酸酶作用后，512nm处检测得的荧光强度正比于碱性磷酸酶的活性。

所述的荧光探针可用于细胞内碱性磷酸酶的检测，实现细胞内碱性磷酸酶的荧光成像；所述的荧光探针可用于斑马鱼体碱性磷酸酶的显色。