[发明专利]重组蛋白HarpinZΔ89-124的应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及重组蛋白HarpinZ_Δ89-124的应用。

背景技术

Harpin蛋白是由植物病原细菌产生的一类蛋白质激发子，可以激发非寄主植物产生过敏性细胞死亡((hypersensitive cell death,HCD)，诱导植物产生防卫反应，促进植物生长。Harpin蛋白的这些有益效应，可能是通过蛋白质不同的功能域实现的，因此分离、鉴定Harpin蛋白中与抗病、促生有关的功能区域至关重要。

在丁香假单胞菌属中，对于菜豆致病变种P.syringae pv.phaseolicola功能域的研究最透彻，认为C-末端对其功能行使至关重要(M.Haapalainen et al,2011)，但其中对功能域的研究仅仅局限于理化性质研究，如多肽结合位点，原生质膜脂类结合部位及孔洞的形成等方面，缺乏对植物促生抗病方面的研究。因此，研究Harpin蛋白中与植物抗病、促生等在植物上的有益效应相关的功能区域具有重要意义，为harpin蛋白在农业生产中的应用提供基础。本实验室前期已经从丁香假单胞大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)S1菌株中克隆到大小为1038 bp的hrpZ基因，并利用大肠杆菌表达。研究表明，HarpinP_sgS1具有诱导烟草抗病和促生的效果。本发明在此基础上，通过研究HarpinP_sgS1中决定HR反应、抗病、促生等生物学效应的功能域，得到抗病、促生效果更好的短肽片段，更易于体外表达，提高产量和节约成本，利于微生物蛋白农药的产业化。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组蛋白HarpinZ_Δ89-124的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的重组蛋白HarpinZ_Δ89-124在提高烟草抗烟草花叶病毒病效果、促进水稻生长、提高水稻抗白叶枯病中的应用。

其中，所述的重组蛋白HarpinZ_Δ89-124通过以下步骤制备得到：

(1)以DH5α/pMD18-T-hrpZ_PsgS1菌株提取的质粒DNA为模板，用上游引物hrpZ_Δ89-124-P1、下游引物hrpZ_Δ89-124-P2进行反向PCR扩增，用凝胶回收试剂盒将反向PCR扩增的片段回收纯化，利用T4 DNA连接酶将回收后的片段进行DNA分子自行环化后，转入大肠杆菌DH5α，经酶切及测序验证得到阳性重组菌株DH5α/pMD18T-hrpZ_Δ89-124，其中上游引物hrpZ_Δ89-124-P1序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物hrpZ_Δ254-298-P2序列如SEQ ID NO.4所示；

(2)阳性重组菌株DH5α/pMD18-T-hrpZ_Δ89-124提质粒DNA，经BamH1和EcoR1双酶切后连接到表达载体pET30a(+)上，转入大肠杆菌BL21后经质粒PCR及酶切鉴定出阳性菌株BL21/pET30a(+)-hrpZ_Δ89-₁₂₄；

(3)利用LB培养基培养阳性菌株BL21/pET30a(+)-hrpZ_Δ89-124，并利用IPTG诱导重组蛋白表达，菌体经超声波破碎获得粗提蛋白，纯化后得纯化的重组蛋白HarpinZ_Δ89-124。

有益效果：

1.本发明获得了一个HarpinZ_PsgS1蛋白的功能片段HarpinZ_Δ89-124，为HarpinZ_PsgS1截去第89-124位氨基酸之后的一个重组蛋白，该蛋白能够在大肠杆菌体内稳定表达，纯化后每升菌液可得到纯蛋白约40mg。

2.本发明所获得的重组蛋白HarpinZ_Δ89-124在植物上具有比全长HarpinZ_PsgS1更好的生物学效应，同浓度的两个蛋白处理烟草、水稻后，HarpinZ_Δ89-124对烟草抗花叶病毒病效果、对水稻抗白叶枯病效果、水稻促生长效果都显著优于全长HarpinZ_PsgS1。