[发明专利]一种水稻的miRNA及其前体基因和它们在对镉敏感转基因水稻的育种上应用

权利要求书

1.一种水稻的miRNA，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的水稻的miRNA的前体基因，前体基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述的水稻的miRNA或权利要求2所述的前体基因在水稻镉胁迫应答调控机制中的应用。

4.含有权利要求2所述的前体基因的pMD19-T载体。

5.含有权利要求2所述的前体基因的质粒。

6.含有权利要求2所述的前体基因的农杆菌感受态细胞EHA105。

7.一种具有对镉敏感转基因水稻的育种方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：将包含权利要求2所述的前体基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到水稻愈伤组织，筛选培养，获得纯合的水稻转基因株系。

8.根据权利要求7所述的一种具有对镉敏感转基因水稻的育种方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

1)提取野生型水稻中花11七天龄幼苗DNA：

取约0.2g水稻叶片用液氮研磨成粉末，转移粉末到加有500μl提取液的离心管中，提取液包括100mM Tris-HCl，pH 8.0；20mM EDTA；500mM NaCl，轻轻混匀；向管中加入100μl 10％SDS溶液，混匀，65℃保温20min；然后加氯仿/异戊醇/乙醇(20:1:4)混合液600μl，氯仿/异戊醇/乙醇体积比为20:1:4，室温静止10min；4℃，12000rpm离心10min，转移上清至另一离心管中。加入1ml预冷的无水乙醇充分混匀，-20℃沉淀DNA 20min；4℃，12000rpm离心10min，弃上清，加70％乙醇500μl进行洗涤；4℃，12000rpm离心10min，弃上清；轻微离心，用移液器将残留液体吸干；吹干DNA沉淀后，溶于100μl含RNase酶TE中，RNase酶的浓度为10μg/ml，37℃水浴30min，-20℃保存；根据miR268前体序列，在database中查阅其所在基因组位点的两端的序列，分别在前体发夹结构两端约50bp处设计引物，所设引物如下：

miR268-F，5’-CGGGGTACCTAACAGGAGAGCTGGACC-3’

miR268-R，5'-AACTGCAGCATCCGAGTGACAATCAG-3'；

2)接着以DNA为摸板，利用所设引物扩增miR268前体基因：

PCR反应体系为50μl，依次加入DNA模板1μl、10×PCR buffer 5μl、10mM dNTPs4μl、10μM正向引物miR268-F 0.8μl、10μM反向引物miR268-R 0.8μl、5U/μl的TaKaRa Taq聚合酶0.5μl，最后加ddH₂O补至50μl；PCR反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火59℃30s，延伸72℃30s，30个循环，最后延伸72℃10min，4℃保存；

3)扩增后将miR268前体基因DNA产物，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，操作如下：

将DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入1.5ml的Eppendorf管中，称取重量；加入6倍体积溶胶液PN，50℃水浴放置30min；将溶胶液加入吸附柱CA2中，室温放置2min，12000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液；加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液；12000rpm离心2min，室温放置数分钟彻底晾干；将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，加入40μl洗脱缓冲液EB，12000rpm离心2min收集DNA溶液；

4)将回收的miR268前体基因DNA与pMD19-T载体TakaRa进行连接反应：

连接体系10μl，分别加入0.5μl pMD19-T载体、4.5μl纯化的miR268前体的DNA、5μl Solution I；16℃下连接3h后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中；通过Amp筛选，挑取阳性克隆，经PCR反应验证及测序鉴定正确后，选取正确的菌液提取质粒pMD19-miR268；

5)将提取的质粒pMD19-miR268和DNA双元质粒载体pCAMBIA1301同时都用TakaRa公司生产的KpnI和PstI进行双酶切：

酶切体系50μl，包括5μl 10×M buffer、28μl pMD19-miR268质粒或pCAMBIA1301质粒、1μl KpnI、1μl PstI和15μl ddH₂O，37℃水浴过夜；将DNA双元质粒载体pCAMBIA1301和克隆质粒pMD19-miR268酶切后，割胶回收DNA片段。接着用T4连接酶连接，连接体系10μl，包括1μl pCAMBIA1301载体、7.5μl miR268DNA、1μl 10×T4连接酶buffer和0.5μl T4连接酶，16℃连接过夜；然后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行菌液PCR，并提取质粒进行酶切鉴定，将正确的植物表达载体p1301-miR268导入农杆菌感受态细胞EHA105；

6)经鉴定正确的阳性质粒p1301-miR268，通过农杆菌介导法转化到水稻愈伤，操作如下：

首先活化农杆菌，在含50mg/L卡那霉素和40mg/L利福平的YM培养基上划线，28℃暗培养；收集农杆菌菌体，将其悬浮于含有200μM已酰丁香酮的AAM液体悬浮培养基中；调整菌体浓度至OD600为0.8～1.0，倒入含继代培养1周的水稻愈伤组织的无菌三角瓶，侵染10min，并不时晃动；然后将愈伤组织置于无菌的滤纸上沥干30min后，置于铺有一层无菌滤纸的固体共培养培养基上，25℃暗培养3天；将共培养后的愈伤组织用无菌水清洗5-6次，再用含500mg/L头孢拉定的无菌水清洗1～2遍，置于无菌滤纸上沥干1小时；将晾干的愈伤转入含500mg/L头孢拉定和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，28℃，暗培养14天；然后将长有抗性愈伤的初始愈伤转到新的含500mg/L头孢拉定和50mg/L潮霉素的培养基上进行第二轮选择，28℃，光照培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出；选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到含有潮霉素的分化培养基上，于25℃，12h光照/12h黑暗条件下培养；待再生小苗长成约1cm高时，将其移到生根培养基上壮苗，25℃，12h光照/12h黑暗条件下培养；最后将转基因苗挑出，加入适量蒸馏水炼苗3天至一周，洗去琼脂，培养箱水培1周，移栽到温室的土钵中生长；挑选生长正常的植株，进行潮霉素PCR筛选和GUS染色，获得阳性T0代植株，共21个株系；收获T1代种子繁种并鉴定至T2代，获得纯合的转基因株系。