[发明专利]一种伯克氏菌及其在防治三七土传病害中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种菌株，具体涉及一种伯克氏菌株及其在防治三七土传病害中的应用。 

背景技术

三七是云南文山地区主要的经济作物，性喜温暖阴湿，其独特的生长环境容易诱发多种土传病害。由于三七神奇的药用功效，全球对三七及其相关产品的需求日益增加，而可供种植三七的区域并不多，因此大多数地区采取三七连作的种植方式。随着三七种植年限的增加，土传病害的种类、发病面积及严重程度逐年增加，严重损害三七的产量和质量，其中最主要的病害为根腐病。 

根腐病是由于土壤中微生物失调，大量病原性和真菌侵染三七植株根部导致的，土壤中微生物失调是导致三七连作障碍的一个重要因素，目前常用的治理方法主要是施用杀菌剂，但是效果越来越不理想，而采用高效熏蒸剂进行土壤灭生处理，然后再补充益生菌剂调整微生物区系使土壤活化和健化的方法则成本较高，效果也不理想。 

伯克氏菌是一种假单胞菌，广泛分布于自然环境中，不同的菌株表型相同，但是基因型不同，有些类型的伯克氏菌在农业上可用作生 物降解、生物控制及促进植物生长之根圈微生物，但还有一些是植物致病菌甚至是人体条件致病菌，而且由于伯克氏菌具有较强的抗生素抗药性及较高的运动性，因此，在农业上应用伯克氏菌具有一定的潜在风险，在菌株的选择上需得非常谨慎。中国专利201010290583.8公开了一种水稻根围伯克氏菌，这个菌株在防治水稻纹枯病方面有非常好的效果，但是用这个菌株的菌悬液接种烟叶时，会在24小时内导致典型的过敏反应，因此，如果要利用伯克氏菌解决不同作物的土传病害，如何分离纯化出最合适的伯克氏菌株就很重要。 

目前对于三七连作障碍已有较多的研究，但是利用三七根际土壤中的益生菌，尤其是伯克氏菌来抑制三七土传病害的发生，从而在一定程度上解决三七连作障碍的研究尚未见诸报道。 

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种伯克氏菌株及其在防治三七土传病害中的应用方法。 

本发明所提供的一种伯克氏菌菌株(Burkholderia arboris)YIM AF 1514，于2014年9月24日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.9733。 

本发明提供伯克氏菌菌株YIM AF 1514，是从云南省文山红壤三七种植区的三七根际土壤中分离得到的，具体步骤为： 

(1)土样处理：准备灭菌1h后的三角瓶，纯水，以及玻璃珠。将玻璃珠放入装有20ml无菌水的三角瓶中，并取2.0g新鲜土样加入三角瓶中，混匀，室温下150r/min摇匀45min。 

(2)涂布：取1mL(1)中的混悬液加入9.0mL无菌水，连续稀释3次获得稀释度为10^-4的样品液，接着取120μL样品液均匀涂布在分离培养基(牛肉膏蛋白胨)上，并做三个重复。 

(3)培养与纯化：涂布好的平板于28℃培养3天，之后挑取在牛肉膏蛋白胨培养基上的单个菌落在ISP2琼脂培养基上画线纯化培养，纯化培养后得到的菌株作为供试菌株，并用牛奶管将菌株进行暂时保藏。 

(4)分类地位的确定：提取供试菌株的DNA,进行16SrRNA测序确定菌株的分类地位。 

(5)活性筛选：采用水琼脂扩散法进行活性筛选，将其菌株发酵3天，取其发酵液作用于混有病原菌的培养基(培养基成分：0.8％的多聚蛋白胨，0.4％的酵母提取物)中，观察其透明圈的大小。 

(6)活性验证：将其新鲜菌体接种于混有病原菌的培养基(培养基成分：0.8％的多聚蛋白胨，0.4％的酵母提取物)上，观察其抑菌圈的大小。 

通过以上实验筛选出抗菌效果最好的一株菌株(YIM AF 1514)，并扩大培养，提取其DNA，通过16SrNA克隆测序确定其分类地位，并于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。 

本发明所提供的伯克氏菌菌株(Burkholderia arboris)YIM AF 1514的主要表型及生物学特征如下：该菌为革兰氏阴性细菌，需氧型，在培养基(含0.8％的多聚蛋白胨+0.4％的酵母提取物)上生长的菌落为圆形，呈密黄色，表面及边缘光滑、潮湿，电镜下观察呈棒状。该菌最适合生长温度为28-30℃，pH为5.5-6。 

本发明还提供了一种采用上述保藏编号为CGMCC NO.9733的伯克氏菌菌株YIM AF 1514制备的菌悬液，所述菌悬液浓度为OD600＝1.62，可直接应用于防治三七土传病害。