[发明专利]一种利用高速逆流色谱分离纯化制备安哥拉苷C、桃叶珊瑚苷和哈巴苷的方法

说明书

(一)技术领域

本发明属于天然药物分离领域，涉及一种分离纯化安哥拉苷C、桃叶珊瑚苷和哈巴苷的方法，尤其涉及一种利用高速逆流色谱分离纯化高纯度安哥拉苷C、桃叶珊瑚苷和哈巴苷的方法。

(二)背景技术

玄参为玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl的干燥根。中医认为玄参味甘、苦、咸，其性微寒，具有滋阴凉血、泻火解毒等功效，一般用于热病烦躁、发斑、夜寐不宁，自汗盗汗，喉咙肿痛等症，为临床常用中药。

现代医学表明，玄参中含萜类、苷类、生物碱等成分，具有抗炎、抗肿瘤、保肝作用。

安哥拉苷C分子结构式如下：

桃叶珊瑚苷分子结构式如下：

哈巴苷分子结构式如下：

现有技术一般采用普通色谱柱法、重结晶等传统的分离方法分离植物中的有效单体，不仅费时费力、污染环境，且所有固定相对样品有不可逆性吸附作用。高速逆流色谱(HSCCC)是近年来发展起来的一种连续的无需固体支撑物的高效、快速的液液分配色谱分离技术，具有分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和、节约溶剂等特点，已经广泛应用于生物、医药、环保等领域化学物质的制备分离和纯化。

(三)发明内容：

本发明的目的是提供利用高速逆流色谱制备安哥拉苷C、桃叶珊瑚苷和哈巴苷的方法，以克服现有技术中存在的上述问题。

本发明通过以下技术方案实现：

一种利用高速逆流色谱分离纯化制备安哥拉苷C、桃叶珊瑚苷和哈巴苷的方法，由粗提物的制备和粗提物的分离纯化两部分组成，其特征在于粗提物的分离纯化应用高速逆流色谱来进行，具体的，所述方法包括以下步骤：

(1)将玄参药材粉碎成粗粉，加入体积分数30％的乙醇溶剂中，加热至回流提取1-3次，提取液趁热过滤，冷却，滤液减压除去溶剂，得到乙醇提取物；

(2)将乙醇提取物加入填充有大孔吸附树脂的色谱柱中，用水和乙醇的混合溶剂梯度洗脱，分别收集含有安哥拉苷C的洗脱液、含有桃叶珊瑚苷和哈巴苷的洗脱液，减压回收乙醇，干燥、分别得到安哥拉苷C粗提物、桃叶珊瑚苷和哈巴苷混合粗提物；

(3)将安哥拉苷C粗提物进行高速逆流色谱分离，以体积比为4：6：10的正丁醇、乙酸乙酯、水组成高速逆流溶剂体系，将所述高速逆流溶剂体系混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在500～1000r/min转速(优选800r/min转速)下，以0.5～5ml/min(优选1.8ml/min)的流速注入流动相，以波长190-380nm(优选210～240nm)的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，取安哥拉苷C粗提物，用上相、下相体积比1：1的混合溶剂溶解后进样，根据紫外检测器光谱图的峰形收集含安哥拉苷C的流出液，浓缩、干燥，制得安哥拉苷C粗品；

(4)将安哥拉苷C粗品用中低压制备色谱进行纯化，用水、甲醇体积比1：1的混合溶剂进行等度洗脱，流速35mL/min，根据波长210nm的紫外检测器的光谱图的峰形收集含安哥拉苷C的洗脱液、减压浓缩，冷冻干燥，制得安哥拉苷C纯品；

(5)将桃叶珊瑚苷和哈巴苷混合粗提物进行高速逆流色谱分离，以体积比为2:7:8:8的正丁醇、乙醇、硫酸铵饱和溶液、水组成高速逆流溶剂体系，将所述高速逆流溶剂体系混合充分后静置，按上下两相分开，取下相为固定相，上相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在500～1000r/min转速(优选800r/min转速)下，以0.5～5ml/min(优选1.5ml/min)的流速注入流动相，以波长190-380nm(优选210～240nm)的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，取桃叶珊瑚苷和哈巴苷混合粗提物，用上相、下相体积比1：1的混合溶剂溶解后进样，定时收集流出液，用HPLC检测，合并相同成分的流出液，分别得到含桃叶珊瑚苷的流出液和含哈巴苷的流出液，浓缩、干燥，分别制得桃叶珊瑚苷粗品A、哈巴苷粗品；

(6)将桃叶珊瑚苷粗品A通过中低压制备色谱分离，用水和甲醇的混合溶剂梯度洗脱，流速35mL/min，波长210nm的紫外检测器检测，定时收集洗脱液，用HPLC检测，合并相同成分的洗脱液，收集得到含桃叶珊瑚苷的洗脱液，浓缩，干燥，制得桃叶珊瑚苷粗品B；