[发明专利]狂犬病毒SNK-CTN株及其应用

权利要求书

1.一种人二倍体细胞狂犬病毒株，其特征在于，通过以下方法制备得到： 

1)取细胞库中的MRC-5细胞进行复苏，培养3天成单层细胞后，将MRC-5细胞培养瓶中细胞培养液倒掉，用0.25％胰蛋白酶消化液进行消化，分散成均匀的细胞，按照0.01～1.0MOI剂量进行接种狂犬病毒CTN-1V5株悬液，37℃培养2～3天，换成含有2～4％牛血清的维持液，33～35℃培养3～5天后收获病毒液，冻存于-70℃，制备成病毒悬液； 

2)以上述的方法，连续在MRC-5细胞上传30～32代。该狂犬病疫苗毒种(SNK-CTN株)，其保藏号为CGCC No8887。 

2.权利要求1所述的病毒株，其特征在于，所述维持液为MEM系列或199系列培养基加2～4％小牛血清。 

3.权利要求1所述的病毒株，其特征在于，狂犬病毒CTN-1V5株在人二倍体细胞MRC-5上连续传代适应；所获得的人二倍体细胞狂犬病毒株病毒在第6代以后即可达到6.5lgLD50/ml的感染滴度。 

4.权利要求1所述的病毒株，其特征在于，所获得的病毒狂犬病毒抗原含量经酶标法测定可达到大于0.4IU/ml。 

5.权利要求1所述的病毒株，其特征在于，所获得的病毒株在第6代以后即可达到对狂犬病毒CVS株的保护中和指数大于100。 

6.一种狂犬病毒适应株(SNK-CTN)的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 

1)取细胞库中的MRC-5细胞进行复苏，培养3天成单层细胞后，将MRC-5细胞培养瓶中细胞培养液倒掉，用0.25％胰蛋白酶消化液进行消化，分散成均匀的细胞，按照0.01～1.0MOI剂量进行接种狂犬病毒CTN-1V5株悬液，37℃培养2～3天，换成含有2～4％牛血清的维持液，33～35℃培养3～5天后收获病毒液，冻存于-70℃，制备成病毒悬液； 

2)以上述的方法，连续在MRC-5细胞上传30～32代。 

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 

取装有MRC-5细胞的冻存管，迅速放入40℃水浴中融化，然后加入到预温至37℃的MEM细胞培养液中，置于37℃培养，经3～4天长成单层后经0.25胰蛋白酶消化后按照0.01～1.0MOI剂量接种CTN-1V5株悬液，37℃培养2～3天，换成2～4％牛血清 的维持液，33～35℃培养3～5天后收获病毒液，冻存于-70℃，制备成病毒悬液；按以上方法，将收获的病毒悬液连续在MRC-5细胞上传30代次，得到狂犬病毒SNK-CTN株。 

8.权利要求1所述的病毒株在制备狂犬病疫苗中的应用，其中所述制备狂犬病疫苗方法如下： 

步骤1，二倍体细胞加载SNK-CTN病毒 

取长满单层的细胞瓶培养的人胚肺二倍体细胞(MRC-5)，经0.25％胰蛋白酶消化细胞，扩增细胞到细胞工厂或生物反应器上，加入MEM细胞培养液，细胞液按0.05-0.IMOI接种SNK-CTN狂犬病毒； 

步骤2，培养及收获 

置37℃培养3天后，弃掉培养液换入维持液。置35℃静置培养3～15天；收获病毒液，收获方法是：细胞工厂收获根据细胞的病变收获2～3次；生物反应器收获根据反应器监测的指标和细胞的病变进行多次收获病毒为病毒收获液；收获液在无菌条件下加入1:4000的β-丙内酯灭活24小时； 

步骤3，提取和纯化方法如下： 

经截留分子量为300KD的超滤膜超滤浓缩40-80倍后，用超速离心机进行纯化，得到纯化的狂犬病毒原液。 

其中用超速离心机进行纯化，方法如下： 

蔗糖密度梯度离心法用10％、20％、30％、40％、50％(W/V)蔗糖溶液作密度梯度，34000rpm超速离心4小时后,经过对紫外吸收峰的抗原含量，蛋白浓度的分析，确定病毒抗原所在位置。 

9.权利要求1所述的病毒株在制备狂犬病诊断试剂中的应用。 

10.一种狂犬病诊断试剂盒，含有权利要求1所述的病毒株。