[发明专利]牛种布氏菌弱毒疫苗株A19的快速检测方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种牛种布氏菌弱毒疫苗株A19的Cycleave PCR快速检测方法。 

背景技术

布氏菌病(简称“布病”)是由布氏菌引起的一种重要的人畜共患传染病，不仅给畜牧业造成严重的经济损失，并威胁人类健康。弱毒疫苗免疫是防控布病的重要手段，但弱毒疫苗的使用往往对布病的诊断和监测造成干扰。实现布氏菌弱毒疫苗与野生菌株的鉴别，对于布病防控工作具有重要现实意义。 

A19株是我国目前在用的布氏菌弱毒疫苗株之一，其鉴别包括血清抗体和病原检测两个方面。A19为光滑型菌株，其LPS含有O-侧链，能刺激机体产生抗体，对牛有一定的保护力，但也使常规血清学检测方法难以区分疫苗免疫与自然感染。病原分离鉴定，所需营养条件复杂，分离培养需在P2级以上生物安全实验室进行，且难以区分A19与同生物型的其它菌株，限制其广泛应用。 

近年，Real-time PCR技术发展迅速，其检测特异、敏感、操作简便，为A19的鉴别提供了新技术手段。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)指单个核苷酸替代、插入或缺失而形成的分子形态，SNP位点广泛的应用于细菌耐药性基因、细菌分种分型、病毒分型等鉴别检测中。基于Cycling荧光探针的Cycleave PCR方法可以区分SNP位点的差异，其检测具有特异、敏感、快速以及荧光背景低、信噪比高等优势。目前，还没有有效的基于Cycling探针鉴别A19的Cycleave PCR扩增引物。 

发明内容

本发明的目的是提供一种牛种布氏菌弱毒疫苗株A19的Cycleave PCR快速检测方法，从而弥补现有技术的不足。 

本发明首先提供一种用于检测牛种布氏菌弱毒疫苗株A19的引物组，引物信息如下： 

ATT-F:CCAGAATGCGAACGGAGATG(SEQ ID NO:1) 

ATT-R:CTTGAGGGCCAGCAGGAG(SEQ ID NO:2) 

ATT-P:GCTCACGGA(SEQ ID NO:3) 

其中ATT-P的5′端用FAM进行标记；3′端用Eclipse进行标记。 

本发明还提供一种利用上述的Cycleave PCR引物组检测A19的方法，包括有如下的步骤： 

1)待检测基因组DNA的提取：用细菌基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN公司)提取细菌DNA； 

2)Cycleave PCR步骤：根据本发明设计A19的Cycleave PCR引物组，加入反应体系中各组分。反应程序：95℃30s；95℃5s，55℃10s，72℃20s，在72℃进行FAM荧光信号采集，进行40个循环。 

3)结果检测：根据荧光扩增曲线情况，判定检测结果。 

另一方面，本发明的Cycleave PCR引物组可用于制备检测试剂盒。 

本发明引物组及方法的优点如下：1)高效灵敏：在1.5h的时间里，即可完成扩增，扩增模板的最低检出限为4.0×10^-5ng/μl；2)特异性强：采用Cycling标记的荧光探针，特异性针对A19基因组产生荧光扩增信号，而对其它种、生物型的布氏菌、布氏菌弱毒疫苗及常见非布氏菌株，不产生荧光扩增信号；3)操作简便：配置好的Cycleave PCR反应体系，置于荧光定量PCR仪中即可完成整个扩增及结果判定过程，不需要通过琼脂糖凝胶电泳鉴定；4)高通量：根据荧光定量PCR仪的检测孔数量，可以一次性实现48～384个样品的检测。 

附图说明

图1：阳性结果荧光扩增曲线图，其中：曲线1.阳性对照，即A19基因组的荧光扩增曲线；曲线2.阴性对照，即水的荧光扩增曲线。 

图2：Cycleave PCR方法检测A19基因组DNA的灵敏度检测荧光扩增曲线图，其中：曲线1-8.A19基因组DNA的质量浓度分别为40ng/μl，4ng/μl，4.0×10^-1ng/μl，4.0×10^-2ng/μl，4.0×10^-3ng/μl，4.0×10^-4ng/μl，4.0×10^-5ng/μl，4.0×10^-6ng/μl；曲线9.阴性对照。