[发明专利]一种层析纯化法生产破伤风类毒素原液的方法

权利要求书

1.一种层析纯化法生产破伤风类毒素原液的方法，其特征在于，它包括以下步骤：

S1. 前处理：将破伤风杆菌培养液过滤，滤液经30KD的超滤滤膜包超滤浓缩至原体积的1/20～1/10，洗涤浓缩液并收集；

S2. 离子交换层析：将上述浓缩液上样于平衡好的Q-Sepharose Fast Flow层析柱，用15～25mmol/L PB、0.16mol/L NaCl溶液洗脱，收集洗脱峰即为IEX毒素目标蛋白；

S3. 疏水层析：向步骤S2中收集的洗脱液中加入等量15～25mmol/L PB、1.5～2.5mmol/L硫酸铵，并上样于平衡好的Phenyl FF层析柱，使用PB缓冲液洗脱，收集洗脱峰即为HIC毒素目标蛋白；

S4. 一次膜过滤：用PBS缓冲液稀释HIC毒素目标蛋白至600～800 Lf/ml，加入终浓度为20mmol/L的L-赖氨酸盐酸盐，调pH为7.0～7.4，再加入终浓度为0.25%的甲醛溶液，滤膜过滤除菌；

S5. 脱毒：将一次除菌过滤后的毒素分别在2～8℃的温度下放置1d、室温下2d、35～40℃的温度下21天进行脱毒，即为脱毒液；

S6. 超滤：脱毒液经30KD的超滤膜包超滤浓缩至原体积的1/20～1/15，洗涤浓缩液并收集；

S7. 二次膜过滤：将步骤S6的超滤液经滤膜过滤除菌，滤液即为破伤风类毒素原液；

其中，步骤S1、S6中所述洗涤浓缩液的方法为：用15～25mmol/L PB缓冲液反复清洗浓缩液，直至透过液在280nm下的吸光度达到恒定，收集洗涤后浓缩液；

步骤S4中采用氢氧化钠溶液调pH为7.0～7.4；

所述脱毒过程中每5～7天取样测定pH值，并使用氢氧化钠溶液调整脱毒液的pH值为7.0～7.4；

步骤S4、S7中所述滤膜的孔径为0.2μm。